[发明专利]鱼干扰素的制备及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼干扰素的制备及纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

我国海域中有1700多种鱼类，种质资源丰富，品种多样，但制约鱼类养殖的病毒性疾病已成为限制鱼类养殖的最大障碍，并且由于鱼类不同于陆地动物，其通过疫苗预防控制鱼类疾病的方法受到接种方式、扩散方式等的多方面制约。因此，通过鱼类干扰素来控制病毒病已逐步成为首选。

干扰素具有抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节等多种生物学活性，它是机体防御系统中出现最早的细胞因子，并通过激活其他细胞因子的分泌表达，发挥其生物学活性。干扰素产生迅速，几乎作用于病毒复制的整个过程。在鱼类，目前发现I类干扰素也可诱导上百种基因的表达，从而发挥抗病毒，抗细胞增殖，免疫调节，抗原递呈等多种生物学活性。

目前，人类干扰素已经被成功分离纯化并应用于临床。动物干扰素的应用还较少，主要在犬、猪等常见动物应用较多，目前利用鱼类干扰素治疗鱼类疾病的应用几乎为零。

发明内容

本发明的目的是提供鱼类干扰素的制备及纯化方法。

该制备及纯化方法包括以下步骤：

1)将鱼干扰素的成熟肽基因转入原核表达菌株中得到表达所述鱼干扰素的成熟肽基因的包涵体；

2)提取步骤1)得到的所述包涵体，加入到复性液中使所述包涵体复性；

3)分离纯化步骤2)得到的复性的所述包涵体，得到所述鱼干扰素；

所述复性液为由100mM Tris·Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽组成的水溶液；所述复性液的pH为8.0。

所述步骤1)中所述原核表达菌株为Rosetta(DE3)。

所述鱼干扰素的成熟肽基因通过如下重组质粒转入所述原核表达菌株中：所述鱼干扰素的成熟肽基因连接到质粒pET-21a(+)上得到的表达所述鱼干扰素的成熟肽基因的重组质粒。

所述步骤2)中所述复性是在4℃的条件下进行的，且所述包涵体在所述复性液中的浓度为120μg/ml。

所述步骤3)中所述分离纯化是将所述复性的所述包涵体首先经过分子筛分离得到含有所述鱼干扰素的组分，然后将所述组分进行离子交换层析，得到所述鱼干扰素。

所述分子筛所使用的介质为Superdex75，洗脱液为pH8.0的20mM的Tris溶液，层析柱的柱长度与柱内径之比为30∶1。

所述鱼干扰素为石斑鱼α干扰素、虹鳟α干扰素、斑马鱼干扰素、草鱼干扰素和牙鲆干扰素。

所述石斑鱼α干扰素的成熟肽的氨基酸序列为序列表中的序列2，所述虹鳟α干扰素的成熟肽的氨基酸序列为序列表中的序列4。

所述石斑鱼α干扰素的成熟肽的基因序列为序列表序列1的第4位至第483位的核苷酸序列，所述虹鳟α干扰素的成熟肽的基因序列为序列表序列3的第4位至第495位的核苷酸序列。

本发明提供的方法为大批量生产鱼干扰素提供依据，对水产养殖中控制鱼类病毒病具有重要意义。

附图说明

图1为石斑鱼α干扰素的原核表达及包涵体的SDS-PAGE鉴定。其中，由左至右依次为：分子量标准(从上到下短横线所指示的片段大小依次为97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4kD)、Rosetta(DE3)/pET-GrIFNα-2b、石斑鱼α干扰素的包涵体、空菌株Rosetta(DE3)对照、Rosetta(DE3)/pET-21a(+)。

图2为石斑鱼α干扰素的凝胶过滤层析图谱及SDS-PAGE鉴定。

图3为石斑鱼α干扰素的离子交换层析图谱及SDS-PAGE鉴定。

图4为虹鳟α干扰素的原核表达及包涵体SDS-PAGE鉴定。其中，由左至右分别为：分子量标准(同图1)、Rosetta(DE3)/pET-RtIFNα-2b、虹鳟α干扰素的包涵体、Rosetta(DE3)/pET-21a(+)对照。

图5为虹鳟α干扰素的凝胶过滤层析图谱。

图6为虹鳟α干扰素的离子交换层析图谱。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、石斑鱼α干扰素(GrIFNα-2b)的制备与纯化