[发明专利]一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种全球性的高发病，据世界卫生组织最新公布数据显示，2007年全球糖尿病患者人数已达1.8亿，且发病率仍逐年增加。据流行病学统计，我国2010年糖尿病患者近9200万。由于糖尿病设计全身各个系统，甚至诱发许多致使性并发症，严重影响人的劳动能力，并威胁人的生命安全，对人们的健康形成极大的危害。糖尿病主要分为I型和II型，后者占糖尿病患者总数的90％以上。

利拉鲁肽是一种长效治疗II型糖尿病的胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物，属于GLP-1受体激动剂，是首个为II型糖尿病治疗开发的人高血糖素样多肽-1(GLP-1)类似物。由诺和诺德公司开发研制，并于2010年1月25日获得FDA批准上市，于2011年3月4日获SFDA批准在中国上市。利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危险因素有保护作用，为2型糖尿病的治疗带来了新的选择。临床治疗效果令人鼓舞。

该药品在我国完全依赖进口，药品价格昂贵。诺和诺德公司通过基因重组技术生产。多肽固相化学合成因其可定向合成且溶剂用量少等优点而成为多肽和蛋白质药物研究、生产领域中的一个重要技术手段。但化学合成产生的杂质因其性质相近使分离纯化难度大而导致纯化技术成为瓶颈之一，使其产业化带来困难。

目前有报道利拉鲁肽纯化方法为RP-HPLC方法(Journal of Medicinal Chemistry 43，1664-1669，2000)，采用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)，流动相为标准的TFA/乙腈体系，柱温为65度，乙腈的浓度梯度为60分钟内0～100％，分离出目标产物，纯化收率为35％；中国专利200610110898.3和中国专利200510107588采用同样的纯化方法，纯化收率为28％。

利拉鲁肽由于肽链长且因其棕榈酰基存在导致疏水性大强而纯化难度大。本发明提出了一种可纯化固相化学合成得到的利拉鲁肽纯化方法，产品纯度高且收率好且易于产业化。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种纯化固相合成利拉鲁肽粗肽的方法。该方法将固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶液后，通过四步HPLC纯化获得利拉鲁肽，纯度好，收率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种固相合成的利拉鲁肽粗肽的纯化方法，包括如下步骤：

步骤1：取固相合成的利拉鲁肽粗肽溶于乙腈水溶液中获得粗肽溶液；

步骤2：取所述粗肽溶液，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以含有0.1～0.2％三氟醋酸的异丙醇水溶液为A相，含有0.1～0.2％三氟醋酸的乙腈为B相，梯度为20～40％B→40～60％B，进行第一HPLC纯化，线性梯度洗脱，收集目的峰获得第一馏分；

步骤3：取所述第一馏分，以氰基硅烷键合硅胶为固定相，以质量浓度为0.05～0.15％高氯酸的水溶液为A相，质量浓度为0.05～0.15％高氯酸的乙腈为B相，梯度为40％B→70％B，进行第二HPLC纯化，线性梯度洗脱，收集目的峰获得第二馏分；

步骤4：取所述第二馏分，以八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以质量浓度为0.01～0.06％氨水的水溶液为A相，色谱纯乙腈为B相，梯度为30％B→60％B，进行第三HPLC纯化，线性梯度洗脱，收集目的峰获得第三馏分；

步骤5：取所述第三馏分经减压旋蒸浓缩、冷冻干燥，即得。

多肽固相合成中，杂质主要为短的寡核苷酸片段、盐及各种保护基。其中，缺省肽和消旋肽为主要的去除杂质。在本发明中，固相合成粗肽纯度为50～60％，杂质最大含量为5～8％。

作为优选，乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为10～30∶70～90。

作为优选，异丙醇水溶液中异丙醇与水的体积比为15～35∶65～85。

作为优选，步骤2、步骤3或步骤4中，第一HPLC纯化、第二HPLC纯化或第三HPLC纯化的流速为55～2000ml/min。

作为优选，步骤2、步骤3或步骤4中，第一HPLC纯化、第二HPLC纯化或第三HPLC纯化的流速为55～500ml/min。

作为优选，步骤2或步骤3中线性梯度洗脱时间为40min。

作为优选，步骤4中线性梯度洗脱时间为30min。