[发明专利]从臭马比木的嫩叶和嫩枝中提取喜树碱和9-羟甲基喜树碱的方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物提取领域，尤其是一种采用萃取技术从天然药用植物臭马比木的嫩叶和嫩枝中提取喜树碱和9-羟甲基喜树碱两种植物抗癌药物的方法。

背景技术

喜树碱是一种植物抗癌药物，对肠胃道和头颈部癌等有较好的近期疗效。传统的喜树碱是从我国中南、西南的喜树的果实与根皮中提取得到的。然后喜树碱在喜树中的含量极低，单靠从喜树中提取显然无法满足喜树碱的应用需求。1976年，中国化学家高怡生等成功合成了消旋喜树碱，开启了国内人工合成喜树碱的新纪元。之后，又陆续有科学家们改进了喜树碱人工合成的方法。然而人工合成的喜树碱毕竟不是天然的，生产工艺与成本也较高，使得人工合成方法根本无法推广。

臭马比木是一种运用高科技手段在广东省境内人工种植的药用植物，国外有文献（phytochemry, 1972）报道了该植物中含有喜树碱，并且其含量高达万分之二点五。这为喜树碱的人工提取带来了利好消息。2008年，公开号为CN101289452A 公开了一种从臭马比木中提取喜树碱的方法，该方法采用萃取技术，从臭马比木的枝叶中提取了高纯度喜树碱。但该方法采用传统的提取手段，其产量仍然有待提高。

发明内容

为克服传统喜树碱提取量低的缺陷，本发明提供一种先利用微生物发酵再进行高纯度喜树碱和9-羟甲基喜树碱提取的方法。该方法能够极大提高马比木嫩叶和嫩枝中的喜树碱含量，从而提高喜树碱的得率。

本发明提供一种从臭马比木的嫩叶和嫩枝中提取喜树碱的方法，其步骤包括：

（1）预处理：选取新鲜的臭马比木嫩叶和嫩枝，干燥后研磨成粉末；

（2）发酵：按酶料比1.5：1(w/w)加入发酵液，发酵1~3天；发酵温度为20~37℃；

所述发酵液为安琪高糖干酵母或发利干酵母，其浓度为1~11‰(w/w)；

（3）提取：在发酵产物中按0.5~3：1(w/w)的比例加入提取液，加热提取；所述提取液为浓度为10~90%的乙醇溶液；所述加热提取的温度控制在40~75℃之间。

（4）过滤：滤取上清液，即得提取液；

（5）浓缩：在上述提取液中加入0.5~10%（W/V）的二氧化硫和硫酸亚铁（抗氧化剂），浓缩，得浓缩物；

（6）萃取：在浓缩物中加入萃取剂对浓缩物进行萃取，并回收萃取剂，得到萃取浓缩物，所述萃取剂为石油醚或二氯甲烷；

（7）、纯化：在萃取浓缩物中加入10%~90%的丙酮溶液，先采用硅胶柱层析，初步结晶度达到70%左右；再进行低压柱层柱，结晶纯度达到80%左右；再采用FLASH中压柱层析，收集洗脱液，其结晶纯度达到95%左右；最后进行重结晶，得到纯度为99%成品。

所述的重结晶是在洗脱液中按3：2：6的比例加入甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺 (w/w)进行重结晶，收集结晶体凉干，即得到纯度达99%的喜树碱。

本发明又提供了一种从臭马比木的嫩叶和嫩枝中提取9-羟甲基喜树碱的方法，其步骤包括：

（1）预处理：选取新鲜的臭马比木嫩叶和嫩枝，干燥后研磨成粉末；

（2）发酵：按酶料比1.5：1加入发酵液，发酵1~3天；发酵温度为20~37℃，所述发酵液为安琪高糖干酵母或发利干酵母，其浓度为1~11‰(w/w)；

（3）提取：在发酵产物中加入提取液，加热提取；所述提取液为乙醇溶液，其浓度为：10~90%，所述加热提取，温度控制在40~75℃之间；

（4）浓缩：在上述提取液中加入0.5~10%的二氧化硫和硫酸亚铁（抗氧化剂），浓缩，得浓缩浸膏；

（5）萃取：在浓缩物中加入萃取剂对浓缩物进行萃取，并回收萃取剂，得到萃取浓缩物。所述萃取剂为石油醚或二氯甲烷；

（6）分离：在萃取浓缩物中加入丙酮溶液，搅拌均匀后静置12~48小时，抽滤，保留滤液与滤饼；将滤饼用丙酮或乙酸乙酷或氯代甲烷溶解，搅伴后再次抽滤，回收滤液，两次滤液混合，得到的滤液为含9-羟甲氢基喜树碱的粗品；

（7）纯化：将9-羟甲氢基喜树碱的粗品进行柱层析，分段收集洗脱液进行HPLC检测，纯度大于98%的组分直接浓缩干燥，粉碎，得到成品；纯度小于90%重复柱层析；纯度在90%~98%间的加丙酮进行重结晶，直到9-羟甲氢基喜树碱的纯度大于等于98%，晶体干燥粉碎，得到成品。所述洗脱液为丙酮，或脂肪醇，其浓度为20~90% （w/w）。

具体实施方式

下面的实施案例是对本发明的进一步详细描述，但其不意味着对本发明的任何限制。