[发明专利]一种液体蛋白质浓度检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检验、检测技术领域。

背景技术

蛋白质与生命的起源、存在和进化切相关，蛋白质测定涉及到生命科学、食品科学等众多领域。目前蛋白质测定主要有凯氏定氮法、等电点沉淀法、紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法、毛细管电泳法、ELISA法、直接电位法、高效液相色谱检测等。常用的三种经典方法，即凯氏定氮法，双缩尿法和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法。其中考马斯亮蓝法灵敏度最高。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。

被定为国家标准的是凯氏定氮法是19世纪后期丹麦人约翰·凯达尔发明的方法，原理很简单：蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，乘以6.38就可以算出蛋白质的含量。所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，如果样品中还有其他化合物含有氮，此方法就不准确了。在通常情况下，食物中的主要成分只有蛋白质含有氮，其他主要成分(碳水化合物、脂肪)都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。但是如果有人往样品中偷加含氮的其他物质(如尿素、三聚氰胺等)，就可以骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质高含量，用兑水牛奶冒充原奶。

其他蛋白质浓度检测方法亦存在设备昂贵、操作复杂、灵敏度低等不同的问题。

过氧化物酶(PX)是一类从植物、动物、微生物中提取出来的氧化还原酶。在生命活动过程中，过氧化物酶主要是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物以及氧化分解其它毒素。在自然界中各种过氧化物酶虽然具有共同的生物活性，但并不具有相同或相似的结构和作用机理。其中含金属卟啉环的血红素过氧化物酶(HPX)是一类结构相似，功能相同的酶类，属于血红素PX蛋白超家族成员，三价铁卟啉就是其中的一个。

发明内容

本发明的目的是：提供一种液体蛋白质浓度检测方法，它利用三价铁卟啉与蛋白质结合后具有过氧化物酶功能的原理，制备一种蛋白质检测试剂，建立一种对液体样品中蛋白质进行定量测定的检测方法。通过检测反应前后光子数的变化，可计算出待测液体样品中蛋白质的量。

本发明的检测方法是：

1、检测原理是：

液体样品中蛋白质与三价铁卟啉结合后形成复合物，具有过氧化物酶功能，催化过氧化氢(H₂O₂)产生活性氧，氧化鲁米诺，鲁米诺形成一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式本检测，通过检测反应前后光子数的变化，可计算出待测液体样品中蛋白质的量。

2、试剂组成是：

一、以TMB为底物的实验步骤：

实验试剂：

1、三价铁卟啉试剂：次血红素(或次血红素六肽)：4-20μM/L。(I)

2、pH 7.4PBS：KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，NaCL 8.0g，KCL 0.2g，加水至1L。(II)

3、TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液(pH5.5)10mL，0.75％H₂O₂32μL。(III)

4、终止液：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL。(IV)

实验方法：

将三价铁卟啉试剂(I)与不同浓度的蛋白样品用PBS(II)稀释并混匀，在96孔板上每孔加入100μL(I)与蛋白混合液，此时每孔内(I)的浓度在4-20μM/L(因实验不同导致用量不同，常用实验范围为此浓度)，既每孔内含0.2-1μg次血红素(或0.4-2μg次血红素六肽)，然后每孔100μL加入TMB使用液(III)，此时(I)的终浓度为2-10μM/L。反应开始10min后，每孔加入50μL终止液(IV)，然后酶标仪检测450nm吸光值。

二、以鲁米诺为底物的实验步骤：

实验试剂：

1、三价铁卟啉试剂：次血红素(或次血红素六肽)：4-20μM/L。(I)