[发明专利]一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

自上世纪60年代起，就在太湖中发现了蓝藻水华。到目前为止，不仅云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖、武汉东湖和上海淀山湖等大型淡水湖泊已经发生了严重的蓝藻水华污染，而且长江、黄河以及珠江中下游的许多湖泊和水库也都相继发生了不同程度的蓝藻水华。蓝藻水华持续大面积的发生，极大地危害了水体生态系统的结构和功能，某些水华种类产生的藻毒素对人类的健康也构成了直接或潜在的影响。如，微囊藻属(Microcystis)——富营养化水库水体中的常见的优势藻类，隶属于蓝藻门、色球藻纲(Chroococcophyceae)、色球藻目(Chroococcales)、色球藻科(Chrococcaceae)，其部分株系能产生微囊藻毒素。这种毒素是一种肝毒素，人类或动物长期饮用含有这一毒素的水体，可能会引发肝损伤甚至肝癌。正因为如此，各国广泛开展快速检测藻毒素及藻细胞的工作。

现阶段，用于检测微囊藻毒素的方法众多，先后研制出生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、电化学免疫分析法、电化学生物传感器检测法、分子生物学检测法等。但是，分子生物学检测法可以灵敏、快速、准确、高效地检测出物种，它不似高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、电化学免疫分析法、电化学生物传感器检测法等对仪器要求过高，仅靠一台PCR仪即可实现快速检测，费用也相对低廉，在定性及定量实验中已取得较好效果，备受研究人员青睐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中存在的对产毒微囊藻检测方法复杂、仪器要求高等问题，提供一种对产毒微囊藻特异性检测的多重PCR方法及其所使用的试剂盒。

为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本发明提供的技术方案是：一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法，包括如下步骤：

(1).从检测地取样微囊藻，并提取基因组DNA，

(2).设计并合成微囊藻，包括产毒和非产毒株的ropC1基因和产毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyI、mcyJ基因片段的7对引物：

引物序列(5’→3’)

rpoC 1TCF1 CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG，

rpoC 1TCR1 ACTTCATCCAAGACGTGCC；

mcyA TCF1  GCATCGGAGACAGAAACAGG，

mcyA TCR1  AAGTTACCCAAACCGAAAGG；

mcyB TCF1  CCAAACTGGTGCCGAATC，

mcyB TCR1  CAAGATGACAAAGGCAGAAGG；

mcyD TCF1  GCCATTTAGAAGGTGCTGC，

mcyD TCR1  GGCTGAGTGATTTGGGTTTC；

mcyE TCF1  CAAACTGCTCCAGGTATCATTG，

mcyE TCR1  TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG；

mcyI TCF1  TTGGTACTCTGGTGGCTCAC，

mcyI TCR1  CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT；

mcyJ TCF1  TGACCGCTTTAGAATGTGCT，

mcyJ TCR1  ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG

(3).使用上述设计的特异性引物分别进行PCR扩增反应，最后进行电泳凝胶检测。

所述的微囊藻种类，包括但不限于铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、绿色微囊藻(Microcystis viridis)、惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)、水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)、华美微囊藻(Microcystis elabens)、鱼害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe)等。