[发明专利]一种蛇伤快速鉴别的方法

说明书

所属技术领域

本发明属于蛇伤鉴别方法，具体为一种利用包被有蛇毒特异性抗体的酶标条快速鉴别蛇伤的方法。

背景技术

传统蛇伤类型判断是依靠蛇伤临床症状分析来实现的，由于医者经验不足、临床症状不明显或已扩散至无法判断，就会导致误判，耽误蛇伤治疗。为避免传统蛇伤判定的缺陷，世界范围内已有一些国家开展以蛇毒特异性抗体来制备蛇伤快速诊断产品的研究，相关诊断产品利用被蛇类咬伤患者的体液能在短时间内准确地判定蛇伤类型，从而保障抗蛇毒血清的准确使用。尽管有研究表明胶体金、乳胶凝集法等方法在技术上都能用于鉴别蛇毒，从而确定蛇伤类型，但鉴于成本高或者操作复杂等原因，至今尚未有产品得以实际应用。酶联免疫分析方法(ELISA)在蛇毒鉴别中运用最为广泛，其中澳大利亚已经生产蛇伤快速诊断试剂盒用于临床检测，为蛇伤的快速判断与治疗作出了积极的贡献。我国是蛇类资源大国，长江以南地区普遍分布有各类毒蛇，在每年的活动旺季，对当地的人类活动造成了严重的危害。但迄今为止，国内对蛇伤类型的判断仍旧依靠其临床症状表现，缺乏快速、简单、有效的诊断方法用于临床辅助判断蛇伤。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提供一种蛇伤快速鉴别的方法，其特征在于按如下步骤进行：

1.制备抗蛇毒免疫球蛋白(IgG)。选取所需鉴别的6种蛇毒，用20mM PBS溶解后，离心取上清，并测定蛋白含量。皮下多点注射大鼠，制备6种多克隆抗蛇毒粗血清。粗血清先经过硫酸铵沉淀去除非蛋白组分，再通过Hitrap protein IgG柱纯化，获得6种抗蛇毒IgG。

2.筛选蛇毒物种特异性IgG。将蛇毒偶联至活化的CNBr-activated sepharose 4B亲和介质上，等量任取5种蛇毒偶联后的湿润亲和介质共0.3g混合后装入离心浓缩管内管。室温下，500μg的每种蛇毒的抗血清IgG分别与其余种蛇毒偶联的亲和介质在水平摇床温和地混匀2小时。随后离心，用离心浓缩管外管收集未结合组分的洗出液，即为该种蛇毒区别于其它5种蛇毒的物种特异性IgG。

3.蛇毒特异性IgG生物素化。特异性抗体和生物素重量比1∶5混合后，室温震荡结合2小时，随后透析去除未结合生物素，得到生物素化特异性IgG。

4.检测酶标条制作。以8孔酶标条为载体，配有一个“T”形支架。酶标条上设置6个样品检测孔，1个阳性和1个阴性对照孔。各孔经2％牛血清封闭，漂洗控干后在-20度保存。

5.蛇伤快速鉴别。检测时，采集蛇伤患者伤口部位流出液，滴加至各检测孔，依次经过生物素化特异性抗体、亲和素化HRP的结合后，加入TMB显色，根据检测孔的阳性或者阴性结果准确判断蛇伤类型。

上述一种蛇伤快速鉴别方法，具有如下优点：

1.成本低。各种特异性抗体的筛选、测试条和测试过程辅助试剂的制备成本低，无需昂贵的耗材支撑。

2.操作简单。整个检测过程所需组件简单、体积小，无需借助仪器，检测人员无需丰富的临床诊断经验。

3.检测时间短。从低温下取出测试条到显色结束，用时40-45分钟，在蛇伤发生现场或患者运送过程中就能完成。

4.准确性高。借助抗原抗体特异性结合原理，能有效保证待测样品中蛇毒结合到特异性抗体上。借助生物素-亲和素结合原理，能将最终显色效果的信号较传统的双抗夹心法放大4倍，有效保证阳性检测结果能被肉眼准确识别。

本发明已列入杭州市属高校重点实验室科技创新项目(项目合同号：20080433T03)和浙江省科学技术厅重大科技专项项目(项目合同号：2009C13045)。

附图说明

图1是8孔酶标条的结构示意图。

图2是附着有酶标条的“T”形支架的垂直示意图。

图3是实施例中无毒蛇咬伤的示意图。

图4是实施例中银环蛇咬伤的示意图。

图5是实施例中眼镜蛇咬伤的示意图。

图6是实施例中五步蛇咬伤的示意图。

图7是实施例中蝮蛇咬伤的示意图。

图8是实施例中竹叶青咬伤的示意图。

图9是实施例中烙铁头咬伤的示意图。

图10是实施例中测试条失效的示意图。

图1、2中1是阳性对照孔；2是阴性对照孔；3-8是样品检测孔。

具体实施方式

实施例：