[发明专利]α1,2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用

说明书

[技术领域]

本发明涉及一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪及其生产方法与应用，属于转基因生物育种领域。 

[背景技术]

在养猪业中，断奶前后断奶仔猪腹泻(post-weaning diarrehea，PWD)与水肿病(edema disease，ED)是一种重要的传染病。此病从仔猪出生到断奶这一阶段的死亡率高达11.5％～29.5％，给养猪业造成了极大地经济损失。当前一些对仔猪腹泻与水肿病的预防性措施，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚单位疫苗接种，尽管在一定程度上减少了病况的发生与流行，但并没有从根本上去寻求解决，找到一种全新的仔猪腹泻与水肿病的预防与控制策略迫在眉睫。从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起仔猪断奶后水肿与腹泻病、生长发育不良甚至死亡的主要病原菌，其致病因子主要是肠毒素和黏附素。黏附素(adhesion)又称菌毛(fimbriae)或定居因子(colonization factor)，是ETEC菌体表面的一种纤毛样突出物，能与宿主小肠上皮细胞刷状缘相应受体结合，细菌在仔猪小肠黏膜上黏附、定居、繁殖，并产生肠毒素，通过渗透，引发组织胺的释放，导致血管壁损伤，水分大量渗出而引起水肿与腹泻病。因此，PWD和ED产生的前提条件是该细菌能否定植在宿主肠道粘膜表面，仔猪对该病原的易感性则在很大程度上取决于其小肠粘膜上皮细胞上是否存在F18菌毛的受体以及具有显性遗传特性。研究表明， α1，2-岩藻糖转移酶(α1，2-fucosyltransferas，FUT1)基因是ECF18受体蛋白基因的最佳候选基因。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达，以其周期短、效率高和低成本的优点，是研究基因功能、防治病毒、治疗疾病和改良品种制备转基因动物的理想途径之一。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA会发生降解而导致基因表达沉默。鉴于在基因沉默方面的高效性和简单性，该技术已被广泛作为探索基因功能和基因治疗等领域的工具。 

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。目前慢病毒也被广泛地应用于RNAi的研究中，但是在哺乳动物中的研究并不多。现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染和病毒载体介导的基因转移方法等。与真核表达质粒相比，利用高效的慢病毒系统，病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中，具有更好的稳定性。质粒的转染效率明显低于慢病毒载体，因为质粒转染不少属于瞬时表达，目的基因常常随时间的延长而发生丢失，会随着有丝分裂而吸收或者导致核酸酶活性的升高，而且质粒不能转染非分裂细胞。慢病毒载体介导的RNAi具有高效，稳定和特异性很强的特点，它能在哺乳动物的受体细胞实现长时间稳定的效应。 

为了进一步研究FUT1基因的功能以及探索一条利用RNAi技术培育抗仔猪腹泻与水肿病的猪新品种，我们针对猪FUT1基因的编码区选取了4个不同位点的片段，在Invitrogen公司商品化的载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR和 pLenti6.3/V5-DEST^TM的基础上，构建了4个关于FUT1基因的RNAi慢病毒表达载体。将构建好的真核表达载体利用脂质体共转染293T细胞，通过Real-timePCR和Western Blot的方法综合筛选出2条针对FUT1基因有效的RNAi靶位点，选取干扰效应最显著的第3个靶位点来构建慢病毒表达载体并包装成慢病毒。将该RNAi慢病毒颗粒感染梅山猪胎儿成纤维细胞，并添加一定浓度的灭稻瘟素(Blasticidin，BSD)筛选出稳定细胞系。通过体细胞核移植技术生产了基于该转基因细胞系的克隆胚胎，并选择同期发情的皖北黑猪作为待孕受体母猪，将经体外培养得到的早期胚胎植入母猪体内妊娠后，获得了α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的克隆猪。 

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种α1，2-岩藻糖转移酶基因沉默的体细胞克隆猪。