[发明专利]一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法

权利要求书

1.一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤为：取吸烟者尿液样品加入混合内标溶液，采用固相萃取小柱进行净化，洗脱液吹干后进行BSTFA衍生化，冷却至室温进行GC-MS检测。

2.根据权利要求1所述的一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

①吸烟者尿液样品的收集：采集吸烟者24h尿样；

②配制混合内标溶液：以同位素标记物烟碱-d₃、可替宁-d₃、反3′-羟基可替宁-d₃作为内标物，配制浓度均为10μg/mL的混合内标乙酸乙酯溶液；

③配制混合标准溶液：准确称取烟碱、可替宁、降可替宁和反3′-羟基可替宁各10mg，配制浓度均为10μg/mL的混合标准溶液；

④标准曲线的绘制：取50μL混合内标乙酸乙酯溶液和250μL BSTFA，然后加入系列烟碱及其代谢物的混合标准溶液配制成浓度(ng/mL)为2.0，5.0，10.0，50.0，100.0，500.0，1000.0，5000.0的标准溶液，旋涡混合后在70℃水浴中衍生化40min，吸入样品瓶，冷却至室温，进行GC-MS检测；然后以被测物的峰面积与其内标的峰面积的比值(Y)对稀释后的空白尿液中被测物的浓度(X)进行线性回归，求得各种代谢物的标准曲线；

⑤样品前处理：取1mL尿液，加入50μL混合内标乙酸乙酯溶液，按照10000r/min离心5min后取上清液上样至活化过的HLB固相萃取小柱，分别采用1mL甲醇和水进行活化，然后用5％甲醇淋洗柱子；接着用氮气吹干HLB小柱，再1ml甲醇洗脱；收集吹脱液于10mL的试管中；在氮吹仪上于45℃吹干上述洗脱液，分别加入250μL乙酸乙酯和250μLBSTFA，密封，旋涡混合后在70℃水浴中衍生化40min，吸入样品瓶，冷却至室温，进行GC-MS检测；

⑥数据处理与检测：由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。

3.根据权利要求2所述的一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤④和⑤中的烟碱-d₃、反3′-羟基可替宁-d₃分别为烟碱和反3′-羟基可替宁的内标物，可替宁-d₃为可替宁、降可替宁的内标物。

4.根据权利要求2所述的一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤④和⑤中的色谱条件如下：

色谱柱：DB-5MS石英毛细管柱，规格为30m×0.25mm i.d.×0.25μm d.f；

GC进样方式：采用不分流进样，进样量为1μl；

溶剂延迟：5min；

进样口温度：250℃；

载气为He，流速为1.2mL/min；

程序升温方法：

5.根据权利要求2所述的一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：所述步骤④和⑤中的质谱条件如下：

电离方式：EI；

传输线温度：290℃；

离子化能：70eV；

离子源温度：230℃；

四极杆温度：150℃；

每种目标检测物及其内标特征离子：

烟碱：定性离子162m/z、定量离子84m/z；

可替宁：定性离子176m/z、定量离子98m/z；

反3′-羟基可替宁：定性离子249m/z、定量离子144m/z；

降可替宁：定性离子234m/z、定量离子219m/z；

烟碱-d₃：定性离子165m/z、定量离子87m/z；

可替宁-d₃：定性离子179m/z、定量离子101m/z；

反3′-羟基可替宁-d₃：定性离子252m/z、定量离子147m/z。

6.根据权利要求2所述的一种吸烟者尿液样品中烟碱及其代谢物的检测方法，其特征在于：所述尿液收集时晨尿弃去，以后每次尿液都收集于清洁容器中，直至收集了第二天晨尿。