[发明专利]一种用分散式固相萃取快速检测4-羟基香豆素类杀鼠剂残留量的方法

说明书

【技术领域】：

本发明设计了4-羟基香豆素类杀鼠剂残留量的检测方法，特别是涉及分散式固相萃取净化，借助超高效液相色谱-四级杆串联质谱仪检测4-羟基香豆素类杀鼠剂残留量的方法。 

【背景技术】：

4-羟基香豆素类灭鼠剂是目前国内外常用的一类缓效灭鼠剂，被认为是一种较为理想的抗凝血药物。灭鼠剂依其化学结构的不同而主要分为两大类型：一类以4-羟基香豆素为母体，另一类以茚满二酮为母体。两类化合物虽然化学结构不同，但作用机制相同。它们都能在鼠体内竞争性地抑制维生素K，阻碍凝血酶原的合成，从而导致致命的内出血而死亡。 

羟基香豆素类抗凝血杀鼠剂可以分为第一代抗凝血杀鼠剂，如杀鼠灵[3-(1-丙酮基苄基)-4-羟基香豆素，warfarin]、杀鼠迷[3-(1，2，3，4-四氢化-1-萘基)-4-羟基香豆素，Coumatetralyl]，以及第二代抗凝血杀鼠剂，如溴鼠灵(3-[3-(4-溴联苯基-4)-1，2，3，4-四氢萘-1-基]-4-羟基香豆素，Brodifacoum)、氟鼠酮[4-羟基-3-1-四氢-3-(4-(4-三氟甲基苄氧基)苯基)-1-萘基香豆素，Flocoumafen]、溴敌隆[3-(4′-羟基-3-香豆素基)-3-苯基-1-对溴联苯基丙醇，Bromadiolone]等，都在大量使用。第一代抗凝血剂的使用受到多次 繁琐的投药量，和由于长期连续使用而引发的抗药性的制约而受到限制。第二代抗凝血剂既具有急性药物的毒力，又具有第一代抗凝血剂作用缓慢之优点，既能杀死一般鼠，又能消灭抗性鼠。一般将这些抗凝血类药物称之为“多剂量灭鼠剂”、“慢性灭鼠剂”、“缓效灭鼠剂”，或“安全灭鼠剂”。抗凝血灭鼠剂的出现，被公认为是灭鼠研究划时代的进展，是防治农田鼠类和家栖鼠类最重要的药物。这些杀鼠剂有相当高的毒性，如灭鼠灵的大鼠经口毒性LD₅₀(median lethal dose，半致死量)为0.9克每公斤，溴鼠灵属于高毒，大鼠经口的LD₅₀为0.27毫克每公斤。因此，世界各国，如美国FIFRA(联邦杀虫剂杀菌剂杀鼠剂法案)，欧洲植物产品保护指令91/414/EEC，加拿大害虫控制产品法案和规定，日本的农业化学品法令等，都为食品中灭鼠剂的残留情况进行评估并制定相应的限量标准。2007年我国也将溴鼠灵列为进出口蔬菜、水果和粮谷中的高风险残留农药。 

然而随着灭鼠剂的大量施用，鼠药会不可避免地残留在粮食、水果、蔬菜中，影响人的健康。因此，对粮食、蔬菜、水果中杀鼠剂残留的检测十分必要。常见的样品前处理法有浊点萃取、固相萃取等，常用的主要仪器分析方法高效液相色谱法(HPLC)-紫外检测法、高效液相色谱-荧光检测法、气相色谱-质谱法(GC-MS)，液相色谱质谱法(HPLC-MS/MS)等。文献中常见的杀鼠剂多残留检测多见于人或动物中毒案例中血液、尿液以及其他生物样品中高含量杀鼠剂的测定，然而现在国内外对植物食品中低含量杀鼠剂的仪器分析方法却很少报告。随着国家对食品安全法律和法规的日益重视和严格，十分有必 要建立对初级农产品中抗凝血灭鼠剂的快速、高灵敏检测方法，以适应国内市场更以及进出口食品安全检测的需求。通常的样品处理方法，用有机溶剂提取后，将提取液通过固相萃取柱(solid phase extraction)，提取液上样前要将SPE柱活化，上样后，要润洗、洗脱。前处理步骤长，耗费大量溶剂。 

【发明内容】：

本发明要解决的技术问题主要在于避免现有提取净化技术的不足，并首次借助分散式固相萃取的特点，将样品的均化、提取、净化等步骤一体化，大大加快了样品处理效率，环保节能，减轻了工作量。并利用最先进的超高效液相色谱-串联质谱技术准确地定性定量粮谷、蔬菜、水果等产品中一个或多个羟基香豆素类杀鼠剂残留量。 

本发明解决所述技术问题采用的技术方案是： 

(1)选择合适的提取溶剂，利用超声萃取或涡旋法提取样品中目标物。 

(2)选择高效的提取填料，并试验出合适的配比。利用该配方的填料，可以脱除样品中的水分，减少提取液的乳化。 

(3)选择高效的提取液净化填料，并试验出对含高色素和复杂基质的样品的净化配方。利用该净化填料，可以有效净化样品中的基质影响，提高目标物回收率。 

(4)将经过前处理的净化液用UPLC-MS/MS技术检测。 

步骤(1)所用的有机溶剂可以是氯代烷烃类、醇类、酯类溶剂等，其最佳溶剂为乙腈、二氯乙烷、乙酸乙酯等。