[发明专利]在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法

权利要求书

1.在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)乙醇氧化酶基因的扩增：根据毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3’，下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3，在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA；

2)重组表达载体的构建：将目的基因定向克隆进同样经EcoRI和Not I双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS，将该重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS转化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定；

3)将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中：在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3-5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3-6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时制备毕赤酵母GS115感受态，取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3μg上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于28-30℃条件下培养2-4天；

4)多拷贝转化子的筛选：将最小葡萄糖培养基平板上的转化菌落点在含抗生素G418的酵母膏胨葡萄糖培养基选择平板上，筛选出抗生素G418浓度为2.0-4.0mg/ml的菌株；

5)重组菌株的诱导表达：将步骤4)筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中，在200转/分钟转速、30℃下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为l∶100，在200转/分钟转速、30℃下培养24小时；在1500-3000转/分钟转速、室温下离心5分钟，收获酵母沉淀，用体积浓度1％-5％甲醇的缓冲复合甲醇培养基或YPM培养基悬浮酵母，使菌体细胞浓度＝1-2，每隔24小时添加体积浓度1％-5％的甲醇，诱导表达48-96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液；

6)胞外重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33％丙酮在-20℃下沉淀，然后，在4℃、13000转/分钟转速下离心，得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4℃、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，再用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白；

7)胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化：将上述步骤5)中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬，然后用超声波进行破碎，超声波破碎的溶液离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱；用5倍柱体积的上样缓冲液平衡凝胶层析柱，然后加入上述洗脱液并使其在柱内平衡，用上样缓冲液对凝胶层析进行洗脱，得到纯化的胞内重组乙醇氧化酶蛋白。

2.根据权利要求1所述的在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法，其特征在于，步骤3)中所述酵母膏胨葡萄糖培养基为：10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖，pH7.0；所述最小葡萄糖培养基平板为：13.4g/L无氨基酵母氮源、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂粉。