[发明专利]在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法。更具体地说，涉及在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法。

背景技术

乙醇氧化酶是甲醇代谢的重要用酶，它可以催化甲醇及其他低级醇类并将其氧化生成其相应的醛类与过氧化氢。乙醇氧化酶的活性形式为一个分子量为600kDa的同源八聚体，并定位于细胞的过氧化物酶体中。乙醇氧化酶的每一个亚基都含有一个黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶。乙醇氧化酶的亚基是在细胞周质中形成，与黄素腺嘌呤二核苷酸结合后进入过氧化物酶体进行八聚体的组装。

乙醇氧化酶可以有效的通过消耗氧气来催化甲醇及其他低级醇类，事实上，很多基于氧电极的乙醇检测器都是利用固定化的乙醇氧化酶作为其主要介质。基于乙醇氧化酶的乙醇生物检测器在发酵，环境及食品工业等方面有重要的应用。该生物检测器存在以下几个优点：(1)对低级醇类的高度亲和，检测精密度高；(2)该酶的活性形式具有高度稳定性，检测寿命长；(3)在发酵工业，环境工程和食品工业方面检测的实用性强。

乙醇氧化酶的商业化应用的两个重要瓶颈因素是酶的大批量生产与酶的纯化工艺。从野生菌毕赤酵母，假丝酵母，汉逊酵母中分离纯化乙醇氧化酶已有报道，但在这些野生菌中，乙醇氧化酶的表达均为胞内表达，胞内表达的酶相较于胞外来说更难纯化，这样会增加乙醇氧化酶的生产成本。仅嗜热子囊菌NBRC31693可以在胞外表达乙醇氧化酶，但其产量很低，仅为133U/L。

从重组表达方面来说，乙醇氧化酶的异源表达已有过报道，例如在酿酒酵母和大肠杆菌中都进行过乙醇氧化酶的重组表达，虽然表达是成功的，但表达的酶却没有活性。其原因主要归结于乙醇氧化酶的活性结构的装配不仅需要黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶，还需要有特殊的装配环境“过氧化物酶体”。

因此，为满足乙醇氧化酶的大量工业化生产及应用，首先需要克服的是乙醇氧化酶的高表达以及其纯化工艺的简化。本发明的目的是提供一种乙醇氧化酶的重组表达与纯化的方法，以期利用该毕赤酵母工程菌大规模的发酵与纯化乙醇氧化酶。

发明内容

针对现有乙醇氧化酶表达及纯化存在的不足之处，本发明的目的是提供一种在毕赤酵母中重组表达和纯化乙醇氧化酶的方法，利用增加乙醇氧化酶的拷贝数与对发酵条件优化来提高重组乙醇氧化酶的表达量，特别是以麦芽糖为碳源，解除碳源对乙醇氧化酶表达的抑制，使重组乙醇氧化酶的表达量得到提高，且重组乙醇氧化酶可部分分泌到胞外。利用添加的多聚组氨酸融合标签可以达到简化乙醇氧化酶的纯化工艺的目的；另外，多聚组氨酸融合标签的添加提高了重组酶的热稳定性。

该方法通过如下步骤实现的：

1)乙醇氧化酶基因的扩增：根据NCBI上的毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3’，下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3’，在两条引物上分别加上EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA；

2)重组表达载体的构建：将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS，将该重组表达载体pPIC9K-AOX-HIS转化到大肠杆菌DH5α感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定；

3)将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中：在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85μl终浓度为1.0μg/μl的重组表达载体、3-5μl线性化酶和10μl缓冲液，轻轻混匀，37℃下放置3-6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时，根据Invitrogen公司的《毕赤酵母表达手册》制备毕赤酵母GS115感受态，取出100μl制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3μg上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入1ml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均匀后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于28-30℃条件下培养2-4天；