[发明专利]一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法

权利要求书

1.一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在诱导培养基上，温度23℃，暗培养，直至将无菌的未成熟黑松合子胚诱导出胚性愈伤组织，诱导培养基采用DCR基本培养基，在其中添加1~4 mg/L 2,4-D、0.5~2 mg/L 6-BA、30g/L麦芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉；

（2）采用DCR基本培养基，在其中附加2mg/L 2,4-D、1mg/L 6-BA、15g/L麦芽糖，1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，对胚性愈伤组织进行维持与增殖，温度23℃，暗培养，每2~3周继代一次；

（3）先采用DCR基本培养基，在其中附加1.2g/L活性炭、15g/L麦芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，23℃，暗培养7~10d，对步骤（2）的胚性愈伤组织进行预处理；再采用DCR基本培养基，在其中附加10~30mg/L脱落酸、0~50g/L 聚乙二醇（6000）、60g/L麦芽糖、250mg/L MES、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、8g/L肌醇、8g/L琼脂粉和2g/L AC，温度23℃，暗培养65~75d，对预处理后的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养；

（4）先采用DCR基本培养基，在其中附加2g/L AC、8g/L琼脂粉和20g/L麦芽糖，温度23℃，先暗培养5~7d，再光照度2000lx及16/8小时的光/暗培养13~15d，对步骤（3）的成熟体细胞胚进行萌发；然后采用WPM基本培养基，在其中附加1.0mg/L IBA、0.2mg/L NAA、15g/L蔗糖、0.1g/L肌醇和6g/L琼脂粉，温度23℃，光照度2000lx及16/8小时的光/暗培养1个月，进行体细胞胚植株再生；

（5）采用WPM基本培养基，在其中附加珍珠岩、0.1g/L肌醇和15g/L蔗糖，温度23℃，光照度2000lx及16/8h的光/暗培养，对再生植株进行壮苗1个月以上；

（6）采用体积比为1：1：1珍珠岩、土和河沙为基质，对再生植株进行移栽。

2.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（1）中，无菌的黑松未成熟合子胚制备方法为：将黑松球果的珠鳞剥离后取出种子，放入灭菌的小三角瓶中，在超净工作台上用无菌纱布包好，先用75%乙醇表面消毒30s，再用0.1%升汞灭菌4min，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸去纱布表面的水分，最后用两把镊子剥取雌配子体，水平放置于诱导培养基上。

3.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（1）中，诱导培养时间为7~9周。

4.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（1）中，胚性愈伤组织诱导的最佳配方为：DCR培养基＋4mg/L 2,4-D＋2mg/L6-BA＋30g/L麦芽糖。

5.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（2）中，胚性愈伤组织稳定增殖继代次数：继代5次及以上。

6.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（3）中，对胚性愈伤组织进行体细胞胚成熟培养的最佳配方为：DCR培养基＋30mg/L ABA＋25g/LPEG＋60g/L麦芽糖。

7.根据权利要求1所述的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于：步骤（6）中，移栽的再生植株的根长不小于2cm。