[发明专利]一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法

说明书

技术领域

本发明属于林木组织再生技术领域，具体涉及一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法。

背景技术

黑松(Pinus thunbergii)属裸子植物门，松柏纲，松杉目，松科，松属，常绿乔木，高可达30m。喜光，耐干旱瘠薄，不耐水涝，不耐寒，适生于温暖湿润的海洋性气候区域，最宜在土层深厚、土质疏松，且含有腐殖质的砂质土壤生长。因其耐海雾，抗海风，也可在海滩盐土地方生长，生长快，寿命长。材质优良供建筑、家具用材。海滩、河滩可作造林树种，也是园林绿化树种，也可作盆景树种。黑松原产日本及朝鲜半岛东部沿海地区。我国山东、江苏、安徽等省普遍栽培。但当前黑松易感染松材线虫病造成大量死亡，且种苗繁殖技术无法满足大面积的黑松造林。通过植物组织培养快速繁殖植株再生，不仅是造林所需大量苗木的一个重要生产途径，也是生产优良无性系的捷径。

针叶树组织培养研究始于上世纪50年代，由于再生难度大，研究进展缓慢。直到80年代中后期，随着分子生物学研究的迅速发展以及林业生产对优质种苗的需求，才掀起了针叶树种组织培养再生植株研究的热潮。但从目前的研究进展看，针叶树种组织培养植株再生是植物组织培养中难度较大的一个领域。针叶树的组织培养包括器官发生和体细胞胚胎发生两种，其中体细胞胚胎发生是指单倍体或双倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。通过离体培养可以从植物各种器官、组织以及细胞和原生质体中形成类似合子胚的结构，被称为不定胚或胚状体，经体细胞胚胎发生形成的胚状体称为体细胞胚。Gupta等(1993)认为，与器官发生相比，体细胞胚胎发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点。

国外针叶树种体细胞胚胎发生研究起步较早，Hakman等(1985)研究挪威云杉未成熟合子胚培养首次获得胚性组织及成熟体胚。在松属树种方面，1986年，Gupta以糖松(P.lambertiana)成熟胚为外植体首次经体细胞胚胎发生途径获得了完整植株。Taniguchi(2001)以抗松材线虫病黑松的未成熟胚为材料，建立了11个黑松细胞系，但每培养皿成熟的体细胞胚平均为32个，体细胞胚萌发率为28％。Salajova等(2005)以欧洲黑松未成熟的合子胚为外植体，胚性愈伤组织诱导率为5.54％，体细胞胚萌发率最高为47.86％。

在国内，1988年中科院植物所郭仲琛等人首次研究报道了云杉属青杆体细胞胚胎发生。黄健秋等(1995)以云南松成熟胚为外植体的胚性愈伤组织诱导率最高可达35.8％，并获得了再生植株。申晓辉等(2005)以红松5个家系未成熟合子胚为材料，胚性愈伤组织平均诱导率为11.72％。王伟达等人(2009)以未成熟合子胚为外植体，建立杂种落叶松胚性愈伤组织诱导和植株再生体系，胚性愈伤组织诱导率最高为10％，再生植株的移栽成活率为41.8％。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，为黑松大规模无性繁殖育苗提供一种高效途径，解决当前造林种苗紧缺的问题。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括以下步骤：

(1)在诱导培养基上，温度23℃，暗培养，直至将无菌的未成熟黑松合子胚诱导出胚性愈伤组织，诱导培养基采用DCR基本培养基，在其中添加1～4mg/L2，4-D、0.5～2mg/L 6-BA、30g/L麦芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/LMES和6g/L琼脂粉；

(2)采用DCR基本培养基，在其中附加2mg/L 2，4-D、1mg/L 6-BA、15g/L麦芽糖，1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，对胚性愈伤组织进行维持与增殖培养，温度23℃，暗培养，每2～3周继代一次；