[发明专利]一种饮用水消毒副产物对细胞毒性的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于环境保护领域，涉及一种测定饮用水消毒副产物(DBPs)细胞毒性的简便方法。

背景技术

饮用水消毒副产物(DBPs)广泛存在于各水厂的出厂水中，DBPs的种类很多，主要分为两大类，即含碳DBPs(C-DBPs)和含氮DBPs(N-DBPs)。C-DBPs属于较早发现的DBPs，主要分为三类，分别为挥发性三卤甲烷，难挥发性卤乙酸以及其它一些C-DBPs如卤化醛酮等，其中以卤代呋喃酮最为典型。近年来，随着替代消毒剂的单独或联合使用，以及相关研究的不断深入，在饮用水中又发现了越来越多的新型DBPs，即N-DBPs。主要分为：卤代硝基甲烷、卤代乙腈、卤代乙酰胺、N-亚硝胺类物质和卤代氰等。

由于DBPs存在于消毒后的饮用水中，被人体饮用之后会产生一定的毒害作用，并产生一定的健康风险。有研究表明，长时间摄入一定量的DBPs会产生致癌、致畸、致突变等三致作用，所以有必要对DBPs的毒理学作用机制及作用效果进行研究和探讨，以此为水处理工艺的改进提供理论性依据。

目前对DBPs毒理作用机制的研究有一定的局限性，常用的方法有选取老鼠为受试对象，进行活体实验。但是此方法的作用周期长，实验结果的可重复性不高，产生误差偏大。另一类方法是采用鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌为受试生物，进行致突变试验、微核实验以及SOS显色实验等。此方法存在的最大问题在于以DBPs对细菌的作用结果来模拟DBPs作用于人体的效果，由于生物种的差异，使得结果缺乏可信性。而以哺乳动物细胞作为受试体则更有代表性，同时现有发明技术中还未出现有关测定饮用水消毒副产物细胞毒性的方法。所以，有必要形成系统性、简便、操作性强的方法来模拟DBPs作用于人体产生的细胞毒性。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷而提供一种测定饮用水消毒副产物细胞毒性的简便方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种简便快捷，平行性高，可操作性强的测定细胞毒性的方法。该方法能够有效模拟DBPs作用于人体产生的细胞毒性作用，形成系统性的、简便的操作方法。该方法以哺乳动物细胞——小鼠肾细胞为受试体，以传统的细胞增殖实验为模板，在此基础上做适当改进。使用二甲基亚砜(DMSO)作为溶解DBPs的助溶剂，为细胞染毒；作用一定时间后，离心，用细针头吸去上清液；最后加入DMSO，用酶标仪测定吸光度。在实验全过程中，使用排枪进行铺板、加液以及换液等工作。

DMSO作为万能溶剂，可以溶解DBPs，并且在作用于细胞时增加细胞膜的通透性，能更好地发挥DBPs的作用效果。使用针头吸液，可以减少沉淀物甲瓒的吸出量，增加实验结果的准确性。使用排枪铺板加液可以增加复孔的平行性。

一种饮用水中消毒副产物(DBPs)细胞毒性的测定方法，包括以下步骤：

(1)首先将处于对数生长期的细胞放入新鲜培养液中培养；

(2)铺板：将步骤(1)中含有细胞的培养液接种于细胞培养板中，培养过夜，待细胞贴壁；

(3)(3a)用助溶剂溶解饮用水消毒副产物，配制饮用水消毒副产物储备液；

(3b)并将配置好的饮用水消毒副产物储备液与不含细胞的新鲜培养液混合；

(3c)然后，将步骤(2)中含贴壁细胞的培养液中的培养液移除，在细胞中加入步骤(3b)制得的含有饮用水消毒副产物储备液的新鲜培养液，培养一段时间；

(4)移去步骤(3c)中含有饮用水消毒副产物的培养液，用磷酸缓冲液冲洗细胞1～3次，再加入含有噻唑蓝(MTT)的无血清培养液，培养，直至产生蓝紫色结晶甲瓒；

(5)取出细胞培养板，用离心机离心沉淀甲瓒，移去上清液，并加入二甲基亚砜150～200μL/孔，在摇床上震荡10～15min，使甲瓒沉淀完全溶解，测定溶液吸光度。

所述的DBPs指有机类饮用水消毒副产物，包括卤代乙酸、卤代甲烷、卤代乙腈、卤代乙酰胺或卤代硝基甲烷等中的一种或一种以上。

所述的细胞为小鼠肾细胞。

所述的步骤(1)中细胞培养条件为37℃，CO₂培养箱中，避光培养；所述的新鲜培养液是95％DMEM(一种培养基)高糖培养液与5％血清(体积比)的混合溶液。

所述的步骤(2)中的细胞培养板为96孔细胞培养板，由于本方法用来测定细胞毒性，为提高实验结果的准确性和平行性，减少误差，需要设置较多浓度组，并且每个浓度需要较多重复组，故针对本方法使用96孔板能够达到实验要求。