[发明专利]一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用

权利要求书

1.一株枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于：菌株名为WB600(pBE2-S-H)，分类命名为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2012年02月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5757。

2.一种枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：是通过将肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ的编码基因转入枯草芽孢杆菌中，筛选得到的能够分泌表达肝素酶Ⅰ的菌株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述肝素酶Ⅰ的编码基因如SEQ ID NO.1或2所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述肝素酶Ⅰ的编码基因5′-端连接有6×His标签。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的构建方法，其特征在于：步骤为：

(1)利用HindⅢ和BamH Ⅰ分别双酶切重组质粒SacB/pGEM-T Easy和质粒pBE2，回收SacB(H/B)和pBE2(H/B)，将二者用T4 DNA连接酶连接；

(2)连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组质粒pBE2-S，获得重组质粒pBE2-S；

(3)利用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ分别双酶切重组质粒HepA/pGEM-T Easy和质粒pBE2-S，回收HepA(B/E)和质粒pBE2-S(B/E)，将二者用T4 DNA连接酶连接；

(4)连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，筛选阳性克隆并用PCR及质粒双酶切鉴定重组表达质粒pBE2-S-H，最终获得重组表达质粒pBE2-S-H；

(5)以空质粒pBE2-S为阴性对照，利用电转化法将测序正确的重组表达质粒pBE2-S-H转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，在卡那霉素抗性的LB平板上培养24h，挑取阳性转化子单菌落扩增，提取重组质粒，进行质粒PCR验证，获得含pBE2-S-H的转化子WB600；

(6)发酵上述所得到的含pBE2-S-H的转化子WB600，鉴定产物并进行活性测定，若肝素酶Ⅰ活性达13000U/L发酵液以上，即得到能够分泌表达肝素酶Ⅰ的枯草芽孢杆菌工程菌。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)中，电转化法的条件是：电压2kV，电容25μF，电阻200Ω，电击时间4～5ms。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(6)中，发酵的条件是：37℃，200～220r/min培养24h。

8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述步骤(6)中，鉴定产物的方法是通过SDS-PAGE进行的。

9.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在生产肝素酶Ⅰ中的应用。

10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌工程菌在低分子肝素生产中的应用。