[发明专利]一株枯草芽孢杆菌工程菌及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌工程菌，其构建方法，以及其在生产肝素酶Ⅰ中的应用。

背景技术

肝素是一类长链糖胺聚糖，由硫酸化葡糖胺和己糖醛酸以β-1，4糖苷键连接组合而成，临床上主要用来预防血栓或作为体外抗凝血药物使用。低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是从普通肝素中分离得到或裂解肝素产生的低分子量片段，其分子量约在4000Da～6000Da。与普通肝素相比，LMWH具有更多优势，比如生物利用度高、血浆半衰期长、口服易吸收、抗血栓作用显著增强以及诱发出血的作用显著减弱等，从而被广泛应用于血栓栓塞性疾病的预防及治疗。虽然LMWH有诸多优点，但其价格远远高于普通肝素，给患者带来了沉重的经济负担。目前工业生产LMWH的方法多为化学降解和酶降解法，其中酶法具有反应条件温和、专一性高、不引起肝素结构的破坏和不易带入杂质等优点。

肝素酶(heparinase)是一类能够特异性降解肝素和类肝素糖苷键的酶，在清除血液中的肝素抗凝剂、测定肝素的结构以及抗肿瘤等方面都有重要的应用价值。尿毒症患者的血液透析和心脏手术中体外血液循环中残留的肝素用肝素酶来消除，避免了用鱼精蛋白引起的各种毒性反应。由于肝素酶能特异性降解肝素产生特定片段，分析这些片段的结构与功能，可了解肝素的构效关系，促进应用。肝素酶还能作用于胞外基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，这些小分子可抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而阻止新血管形成而起到抗肿瘤作用。另外，肝素酶还有促进伤口愈合的作用(Sasisekharan R，Moses MA，Nugent MA，et al.Heparinase inhibits neovascularization[J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(4)：1524-1528.)(Karthik R，Balagurunathan K.Differential effects of heparitinase Ⅰ and heparitinase Ⅲ on endothelial tube formation in vitro[J]Biochem Biophys Res Commun，2010，398：191-193.)。肝素酶最初是由Payza等(Payza AN，Korn ED.Bacterial degradation of heparin[J]Nature，1956，177(4498)：88-89.)从肝素黄杆菌中发现并由Bohmer等(Bohmer LH，Pitout MJ，Steyn PL，et al.Purification and characterization of a novel heparinase[J].J Biol Chem，1990，265(23)：13609-13617.)分离出来的，目前已经从肝素黄杆菌中分离纯化得到3种肝素酶Heparinase Ⅰ、Heparinase Ⅱ和Heparinase Ⅲ。本发明所述肝素酶Ⅰ分子量43.8kD，等电点8.5，主要降解肝素分子中的2SIdoA(1→4)6SGlcNS糖苷键(Desai UR，Wang HM，Linhardt RJ.Specificity studies on the heparin lyases from Flavobacterium heparinum[J].Biochemistry，1993，32(32)：8140-8145.)，对其催化区域的考察发现，肝素酶Ⅰ有三个底物结合位点、两个钙离子激活位点和一个糖基化位点，而糖基化对肝素酶Ⅰ的酶活没有影响(Sasisekharan R，Ganesh V，Godavarti R，et al.Heparinase Ⅰ from Flavobacterium heparinum：mapping and characterization of the heparin binding domain[J].J Biol Chem，1996，271：3214-3131.)(Liu D，Shriver Z，Godavarti R，et al.The calcium-binding sites of heparinase Ⅰ from Flavobacterium heparinum are essential for enzymatic activity[J].J Biol Chem，1999，274(7)：4089-4095.)。