[发明专利]一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种尼帕病毒的荧光RT-PCR检测方法，特别涉及一种尼帕病毒TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法，属于检验检疫技术领域。

背景技术

1998年，尼帕病首次暴发于马来西亚，引起猪和人的发病和死亡。病原生态学和流行病学调查发现，狐蝠科的食果蝙蝠是本病的病原-尼帕病毒(Nipah Virus，NiV)的自然宿主，在向动物和人传播疫病过程中起到决定性作用。NiV对蝙蝠不致病，对猪有一定的致病性，而对人的致病力很强，人感染NiV后病死率达40％～70％。因此，NiV被列为最危险的生物安全4级病原微生物。

NiV与亨德拉病毒一起同属于副粘病毒科亨尼帕病毒属成员，其基因组全长约18.2kb，含有6个转录单位，依次编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、受体结合蛋白(G)和大蛋白(L)等6个结构蛋白，F和G蛋白是病毒的两个表面糖蛋白。

病毒分离是鉴定NiV最重要、最基本的诊断方法，但需在生物安全4级(P4)实验室进行病毒培养。中和试验是NiV血清学检测的主要方法，同样NiV病毒中和试验也需要P4级的生物安全实验室。美国CDC使用捕获ELISA来检测特异性抗NiV的IgM抗体，澳大利亚动物卫生实验室分别用NiV感染Vero细胞的灭活提取物作为间接EI ISA的抗原来检测血清抗体的效价。目前检测NiV的PCR方法主要有两种，一种是澳大利亚AAHL的RT-PCR，采用巢式引物扩增病毒基质蛋白的M基因，可用于检测固定组织、新鲜组织、脑脊液中的病毒序列；另一种是美国CDC的RT-PCR，用于扩增NiV的N基因。荧光定量PCR技术是一种新型扩增待检基因的方法，采用“闭管”操作，具有操作简便、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好、耗时短等优点，还可避免常规PCR操作时EB染色所造成的危害及PCR后处理可能带来的假阳性。法国与马来西亚合作，于2005年报道了针对NiV N基因的荧光RT-PCR检测技术，该技术中的阳性标准品是用NiV的RNA制备的，也需要在P4级的实验室培养病毒。

近年来在柬埔寨和泰国所进行的病原生态学研究显示，两国境内的蝙蝠群均存在一定比例的NiV抗体阳性率。虽然尼帕病在我国尚未出现，但是由于来自周边国家的疫情威胁以及我国东南沿海地区有与NiV原发地相似的生态环境和动物分布，所以尼帕病对我国造成了明显的威胁。

本病目前尚无有效的方法进行治疗和预防，相关疫苗尚在研究之中。我国是一个养猪大国，一旦发生猪尼帕病毒病疫情并且没有被及时发现而扩散开来，对我国将产生严重的不良后果。我国目前无本病发生，应加强对进口猪的检疫，防止该病传人我国。因此，建立NiV的监测与诊断技术对于构建预警与应急技术平台防范尼帕病进入我国具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明人经过大量研究实验，建立了一种基于M基因的尼帕病毒荧光RT-PCR检测方法，本发明方法准确、快速。

本发明通过以下技术方案实现：

1.合成引物及TaqMan-MGB探针

比对GenBank中公布的12株尼帕病毒基因组M基因序列，选择尼帕病毒基因组M基因的保守区序列作为PCR扩增的靶序列，通过筛选确定引物对和Taqman-MGB探针的序列为：

引物1：5’-GATGGACATCAATCCTTG-3’，

引物2：5’-CTCTCTTGGAACAGAAGG-3’，

探针：5’-Fam-CTGCTACTCGGCTGATCTCACA-NFQ-MGB-3’；

或者为上述引物序列的互补序列；再或者为上述序列同源性大于75％的序列。

探针序列的5’端标记荧光发光基团，3’端标记末端连接MGB的非荧光淬灭基团。标记探针的荧光发光基团可以为FAM、TET、JOE、HEX、NED荧光报告基团的中的任意一种。

2.构建阳性对照假病毒

采用常规方法人工合成一段包含适合引物及探针序列的尼帕病毒基因组M基因片段，然后通过双酶切、连接，构建插入该基因序列的慢病毒表达载体，再将慢病毒表达载体和包装质粒同时转入包装细胞中，从而瞬时表达慢病毒表达载体的转录子以及包装所需的蛋白，最终获得用于制备标准品或对照品的假病毒。

3.建立优化的一步法荧光RT-PCR反应体系

RT-PCR反应组份包括：

1)2X Master Mixwithout UN

2)40X MultiScribe