[发明专利]构树内生真菌的分离筛选方法及其用途

权利要求书

1.一种耐重金属Zn的构树内生真菌的分离筛选方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（a）材料预处理：采集新鲜构树的根、茎段和成熟叶，用双蒸水冲洗干净后，无菌水略洗；

（b）材料消毒：将步骤（a）的构树成熟叶用75% EtOH 漂洗1min，无菌水冲洗，2.5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；步骤（a）的构树根和茎段用75% EtOH漂洗1min，无菌水冲洗，5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；

（c）构树内生真菌的分离：将步骤（b）的成熟叶用无菌滤纸吸干水分后切成组织块，根、茎段剥去根皮亦切成组织块，接入PDA培养基；

（d）构树内生真菌的纯化：将分离繁殖出的不同种类的构树内生真菌接入PDA平板纯化；

（e）含重金属Zn的培养基的配制：PDA培养基高温灭菌后，加入150-250 mmol/L无菌的ZnSO-₄ · -7H₂O轻轻振摇使其溶解均匀；

（f）耐受重金属Zn构树内生真菌的筛选：将步骤（d）所分构树内生真菌接种在步骤（e）的培养基上，26℃培养一周，挑出长出的菌落，即为重金属Zn耐受菌株。

2.构树内生真菌在修复重金属污染土壤中的应用，其特征在于，所述的构树内生真菌是按照权利要求1的方法分离筛选得到的。

3.一种具有抗人肝癌细胞活性的构树内生真菌的分离筛选方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（a）材料预处理：采集新鲜构树的根、茎段和成熟叶，用双蒸水冲洗干净后，无菌水略洗；

（b）材料消毒：将步骤（a）的构树成熟叶用75% EtOH漂洗1min，无菌水冲洗，2.5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；步骤（a）的构树根和茎段用75% EtOH漂洗1min，无菌水冲洗，5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；

（c）构树内生真菌的分离：将步骤（b）的成熟叶用无菌滤纸吸干水分后切成组织块，根、茎段剥去根皮亦切成组织块，接入PDA培养基；

（d）构树内生真菌的纯化：将分离繁殖出的不同种类的构树内生真菌接入PDA平板纯化；

（e）构树内生真菌发酵培养：将步骤（d）所分构树内生真菌接入PDB培养基，置25℃摇床，30-150 r/min，液体发酵培养8-20d；

（f）菌株发酵液的乙酸乙酯提取：步骤（e）发酵液经4500-5500 r/min离心2.5-3.5 min，取发酵上清液，用等体积乙酸乙酯对发酵上清液进行萃取，充分振摇5min，后静置30min，萃取3次，0.05个大气压下减压浓缩30 min，挥干乙酸乙酯；

（g）样品配制：将步骤（f）中的10mg菌株发酵液乙酸乙酯提取物用1ml DMSO溶解后，加入9ml PBS（-）配成1000 μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含0.1% DMSO的PBS（-）稀释100倍；

（h）具备抗人肝癌细胞活性的菌株筛选：MTT法检测步骤（g）的样品液对人肝癌细胞体外增殖的抑制作用。

4.一种具有抗人肝癌细胞活性的发酵液的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（a）材料预处理：采集新鲜构树的根、茎段和成熟叶，用双蒸水冲洗干净后，无菌水略洗；

（b）材料消毒：将步骤（a）的构树成熟叶用75% EtOH漂洗1min，无菌水冲洗，2.5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；步骤（a）的构树根和茎段用75% EtOH漂洗1min，无菌水冲洗，5% NaClO漂洗3min，无菌水冲洗，75% EtOH漂洗0.5min，无菌水冲洗；

（c）构树内生真菌的分离：将步骤（b）的成熟叶用无菌滤纸吸干水分后切成组织块，根、茎段剥去根皮亦切成组织块，接入PDA培养基；

（d）构树内生真菌的纯化：将分离繁殖出的不同种类的构树内生真菌接入PDA平板纯化；

（e）构树内生真菌发酵培养：将步骤（d）所分株构树内生真菌接入PDB培养基，置25℃摇床，30-150 r/min，液体发酵培养8-20 d。