[发明专利]构树内生真菌的分离筛选方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，是构树内生真菌在植物修复和制备抗菌抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

植物内生真菌（fungal endophyte）是指生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各组织和器官内的真菌。它们与宿主植物通过互作形成了紧密的共生关系。内生真菌可以促进植物的生长，提高植物应对生物或非生物胁迫的适应能力。例如，从重金属胁迫环境下植物体中分离得到的内生真菌Mucor sp. CBRF59对Cd和Pb有很强的抗性与富集能力，具有促进植物生长和重金属富集的双重特性（Chen L., Luo S., Xiao X., Guo H., Chen J., Wan Y., Li B., Xu T., Xi Q., Rao C., Liu C., Zeng G. Application of plant growth-promoting endophytes (PGPE) isolated from Solanum nigrum L. for phytoextraction of Cd-polluted soils. Applied Soil Ecology, 2010,46(3), 383-389；Deng Z., Cao L., Huang H., Jiang X., Wang W., Shi Y.,  Zhang R. (2011). Characterization of Cd- and Pb-resistant fungal endophyte Mucor sp. CBRF59 isolated from rapes (Brassica chinensis) in a metal-contaminated soil. Journal of Hazardous Materials, 2011,185(2-3):717-724.）。有些植物内生真菌还被证实具有药用价值，如1993 年Stierle首次从短叶红豆杉（Taxus breviflia）中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌（Taxomyces andreanae），中国专利文献CN 200810041214.8，公告日2010年9月29日，公开了一种抑制肝癌细胞生长的发酵液的制备方法，则发现植物内生真菌长枝木霉（Trichoderima longibrachiatum）发酵产物可抑制肝癌细胞生长。

构树（Broussonetia papyrifera（L.）Vent.）为桑科构属植物，是一种内生真菌宿主植物，呈现丰富的内生真菌多样性，构树与其内生真菌存在协同进化或互作关系。构树具有重金属富集特性，如黄长干等（2004）调查发现江西德兴铜矿污染区域的构树具有良好的植物修复潜力，其生物量在140余种植物中位列第一；赖发英等（2007）调查结果表明构树对污染农田的Cu、Zn具有富集能力；童方平等（2010）对锑矿区构树富集重金属的特性研究发现，重金属Sb、Zn、Pb、As主要富集在构树的枝叶部位（占85％以上）。以往的研究认为，内生真菌与宿主植物富集重金属的能力有密切的关系，包括内生真菌在内的微生物在重金属污染环境中逐渐形成了一些对重金属抗性的种群，它们通过生物吸附、胞外沉淀、生物转化、生物累积和外排作用对重金属毒性产生抗性，并可分泌多聚糖、糖蛋白、脂多糖、可溶性氨基酸等胞外聚合物质，选择性地从环境中结合金属，可用于污染环境的生物修复。如通过生物吸附或积累作用去除废水中的重金属，与内生真菌-植物联合修复重金属污染土壤。由于内生真菌呈丝状生长，接触污染面积大，且生长快，生物量大，分离培养简单，多数内生菌寄主范围广，协同利用微生物和宿主植物对重金属污染土壤进行修复，可以改善植物修复效果，具有广阔前景。但是对于某一宿主植物，究竟何种内生真菌或哪几类内生真菌起到重金属富集作用，是需要进行大量的研究加以证实的，这类内生真菌的筛选出来以后，可制备成菌根菌剂，从而应用于生物修复。

目前关于构树内生真菌尚未见有分离鉴定的报道，也未见有重金属抗性及生物活性方面的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐重金属Zn的构树内生真菌的分离筛选方法。

本发明的再一的目的是，提供构树内生真菌在修复重金属污染土壤中的应用。

本发明的另一的目的是，提供一种具有抗人肝癌细胞活性的构树内生真菌的分离筛选方法。

本发明的第四个目的是，提供一种具有抗人肝癌细胞活性的发酵液的制备方法。

本发明的第五个目的是，提供一种构树内生真菌在制备抗人肝癌细胞活性药物中的应用。