[发明专利]抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法。

背景技术

抗毒素/抗血清（Antitoxin/Antiserum）是指采用特定的抗原免疫动物后，再收集高效价免疫血清，并经过提取、纯化后，制备出含完整抗体（IgG）或抗体片段[F(ab’)₂]的免疫球蛋白制品；以用于预防和治疗各相应疾病引起的感染。

由于抗毒素/抗血清原料来源于马匹，而马匹又饲养在开放的环境中，其可能携带的病毒较多，因而该制品存在生物安全性问题。为了保证该制品的安全性，除要控制免疫马匹饲养环境和原料血浆质量外，在抗毒素/抗血清生产过程中，如何有效除去或灭活原料血浆中的病毒，是获得安全可靠的抗毒素/抗血清等血液制品的关键问题。

目前国内外较为成熟的病毒灭活/去除方法有：巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂法、纳米膜过滤法、光化学法等，但对于动物源性生化提取制品，尤其是规模化生产的抗毒素/抗血清的灭活病毒工艺，国内外至今未见报道。

有机溶剂/去污剂法是利用有机溶剂和去污剂的配伍，破坏病毒的脂质包膜，使其失去传染性，从而达到灭活病毒的目的。参照欧洲药品管理局（EMEA）和我国国家食品药品监督管理局发布的针对人血液制品的相关技术法规在马破伤风免疫球蛋白（F(ab’)₂）生产工艺中增加有机溶剂/去污剂处理病毒灭活步骤，有机溶剂选用磷酸三丁酯，去污剂选用Triton X-100。该方法有很好的蛋白质兼容性，能有效灭活病毒，且对蛋白的结构和功能的影响甚微。但如何从制品中除去加入的有机溶剂和去污剂，则是该方法最大的难点。抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量超过规定的限度会影响人体的健康中，因此，经有机溶剂/去污剂（磷酸三丁酯/ Triton X-100）灭活的马破伤风免疫球蛋白（F(ab’)₂）中磷酸三丁酯的残留量测定是涉及其安全性方面的关键指标之一。

然而磷酸三丁酯在抗毒素/抗血清中的残留量极低，处于ppm极，在测定前的预处理过程中容易损失，容易影响测定的准确性。国内盛凤仙《冻干人纤维蛋白胶制品中磷酸三丁酯残留量的气相色谱法测定》（中国医药工业杂志，2002年，33卷第3期），介绍了一种冻干人纤维蛋白胶中磷酸三丁酯残留的测定方法，但在抗毒素/抗血清制品中相关磷酸三丁酯残留测定方法未见应用。

发明内容

为解决对抗毒素/抗血清制品中磷酸三丁酯残留量的测定，本发明的目的是提供一种经有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，该方法能准确地测定抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量，并且准确、简便、快速。

本发明通过下列技术方案实现：一种抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯残留量的测定方法，包括分别吸取对照品溶液和供试品溶液，采用常规气相色谱法进行测定，再将所得结果按现有技术中的常规内标法计算，即得到抗毒素/抗血清中磷酸三丁酯的残留量，其特征在于所述对照品溶液和供试品溶液的制备经过下列各步骤：

（1）将内标物磷酸三丙酯溶解于正己烷中，制成每1mL正己烷中含磷酸三丙酯300～500μg的内标物溶液；

（2）将对照品磷酸三丁酯溶解于正己烷中，制成每1mL正己烷中含磷酸三丁酯500～700μg的溶液；分别取该溶液10μL、20μL、40μL、60μL、80μL，然后分别在每一溶液中加水3.0mL、加步骤（1）所得内标物溶液50μL以及浓度为1.5mol/L的高氯酸溶液0.75mL，振荡1分钟后，置于37℃下保持10分钟，再分别加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的各上层溶液即为五个对照品溶液；

（3）取供试品抗毒素/抗血清3.0mL，加入步骤（1）所得内标物溶液50μL以及浓度为1.5mol/L的高氯酸溶液0.75mL，振荡1分钟后，置于37℃下保持10分钟，再加入正己烷4mL，振荡2分钟；最后在2000转/分的转速下离心分离20分钟，分离出的上层溶液即为供试品溶液。

所述供试品抗毒素/抗血清是经过有机溶剂/去污剂法灭活后的抗毒素、抗血清。

所述采用气相色谱法进行测定的色谱条件为：气相色谱柱，酸改性聚乙二醇（20M）毛细管柱，柱温140℃，进样系统温度190℃，进样体积为1～2μL，采用火焰离子化检测器或氮磷检测器，检测器温度为210℃。

所述酸改性聚乙二醇（20M）毛细管柱为HP-FFAP或DA-FFAP，规格为25m×0.320mm×0.50μm。