[发明专利]一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒，特别是涉及了一种应用环介导等温扩增技术在DNA分子水平上高灵敏特异性检测食源性病原菌空肠弯曲菌的方法。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是能够引起人类急性腹泻和肠胃炎的主要食源性病原菌，具有很强的致病性，人类饮用受污染的水、鲜奶、畜禽肉等都有可能感染该菌致病。加强对空肠弯曲菌的筛查和检测，是有效防控空肠弯曲菌污染、传播及致病的根本措施，而监测和防控食品和环境中空肠弯曲菌的关键是建立高灵敏、快速、简便易行的检测体系。

目前，包括我国在内的许多国家对食源性致病菌检测和鉴定仍主要沿用传统的检测方法(分离培养、生化鉴定等)，而传统的检测方法很难有效地对空肠弯曲菌这类难培养、易形成不可培养的休眠状态的致病菌进行灵敏检测，而且传统的检测方法特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时，不能实现及时准确的监测。

将现代分子生物学技术应用于食源性致病菌检测，是发展新的快速、准确、低成本检测和鉴定食源性致病菌方法的最有效途径。以核酸为基础的分子检测方法以其特异性高、检测结果稳定以及省时省力的特点，在食源性致病菌检测中具有比传统方法更多的优越性，因而也得到了更广泛的研究。目前就分子水平检测空肠弯曲菌，国内外报道最多的是应用PCR技术的检测，已经研究出多重PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等多种检测方法。但PCR采用加热变性双链DNA来促使下轮DNA的合成，其基本原理和对于温度循环的高要求使得PCR的应用受到了限制，不仅需要精密的仪器设备，而且会有非目标DNA序列的扩增，出现假阳性。如何克服PCR技术的不足，在DNA分子水平上快速、准确、灵敏地对空肠弯曲菌进行检测，是食品卫生检测的需要和发展趋势。此外，如何在疫病现场利用匮乏的检测条件进行快速检测也是一个刻不容缓的问题。

本发明通过环介导等温扩增检测食源性病原菌空肠弯曲菌，由此建立一种空肠弯曲菌的高灵敏快速检测试剂盒及其检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一套空肠弯曲菌高灵敏快速检测试剂盒，包括：

(1)针对特异性靶基因flhA(GeneBank基因登录号905174)设计并筛选出用于环介导等温扩增的四条高特异性引物，其序列分别为：

flhA-FIP 5′-ACCCTTGTACTACCTTTTGTTACAA-GTGGAAATATGGTCA-3′

flhA-BIP 5′-ACAAGCAAGATTTACACTTGATGC-GTCCTGCATTTAAATCCG-3′

flhA-F35′-GCATTTGGAGAATTTGTTGTTG-3′

flhA-B35′-TTGACGTCTTGCTCTAGC-3′。

(2)有效的环介导等温扩增反应体系，其中内引物和外引物的浓度比是关键。本发明建立的25ulLAMP反应体系中，内引物(flhA-FIP，flhA-BIP)与外引物(flhA-F3，flhA-B3)浓度比为8∶1。

LAMP反应体系(总体积25uL)：

2.5uL 10XThermopol reaction buffer(含Mg2+)，1uL Target DNA，2uL 10umol/L flhA-FIP，2uL10umol/L flhA-BIP，0.5uL 5umol/L flhA-F3，0.5uL 5umol/L flhA-B3，4uL 10mmol/l dNTPs，1uL 8UBstDNA polymerase large fragment，11.5uL ddH2O。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法，其中反应温度是影响环介导等温扩增效果的重要反应条件，通过比较6个温度梯度(60，61，62，63，64，65℃)水浴中环介导等温扩增结果，最终以63℃水浴为最佳温度条件。应用所述试剂盒检测空肠弯曲菌步骤如下：

(1)提取细菌基因组DNA。

(2)混合LAMP反应体系：在无菌的微量离心管中加入2.5uL 10×buffer、2uL10 umol/LflhA-FIP、2uL 10 umol/L flhA-BIP、0.5uL5umol/L flhA-F3、0.5uL5umol/L flhA-B3、4uL10mmol/LdNTPs、1uLDNA模板、11.5uL的ddH2O，该步暂不加BstDNA polymerase large fragment。