[发明专利]同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法

权利要求书

1.一种同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法，4种重要嫁接传播病原包括柑桔衰退病毒，柑桔裂皮病类病毒，柑桔碎叶病毒，柑桔黄龙病菌，其特征在于：提取柑桔样品总核酸，选用4种病原的特异引物，对待测样品进行(RT)-PCR扩增，同时设计了泛素基因引物序列，体系中设置了泛素基因作为内参基因，最后电泳鉴定：

1)根据泛素基因保守序列区域设计特异引物UBQ-F：GATCTTCGCCTTAACGTTGTCAAT，UBQ-R：GTTGATTTTTGCTGGGAAGCA，作为内参基因，

2)所述(RT)-PCR扩增所需试剂如下：柑桔衰退病毒引物：0.13μmol/L，柑桔裂皮病类病毒引物：0.5μmol/L，柑桔碎叶病毒引物：0.16μmol/L，黄龙病病菌引物：0.4μmol/L，内参泛素基因引物：0.24μmol/L，Mg²⁺为2.7mmol/L，dNTP为0.5mmol/L，6mM DTT，RT/Taq酶，2×RT-PCR Buffer，灭菌去离子水。

(RT)-PCR扩增条件为：55℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；68℃，80s；35个循环；68℃，7min。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在与：所述提取样品总核酸，样品不仅取柑桔植株近基部老叶中脉，同时还应取嫩叶的中脉或嫩皮，并且同一植株的不同方位取样。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在于：所述柑桔衰退病毒引物为：

上游引物：5’-ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’

下游引物：5’-TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’

所述柑桔裂皮病类病毒引物为：

上游引物：5’-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3’

下游引物：5’-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’

所述柑桔碎叶病毒引物为：

上游引物：5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’

下游引物：5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’

所述黄龙病病菌引物：

上游引物：5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’

下游引物：5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’

4.根据权利要求1或3所述的一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，其特征在于：电泳得到的特异性片段大小为：柑桔衰退病毒为511bp，柑桔裂皮病类病毒为371bp，柑桔碎叶病毒为309bp，柑桔黄龙病菌为1160bp，内参泛素基因为194bp。