[发明专利]同时检测柑桔4种重要病原的一步法多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农业分子生物领域，具体的说，涉及一种同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法。

背景技术

我国目前已确定有5种嫁接传播病害，包括黄龙病，衰退病，碎叶病，裂皮病和温州蜜柑萎缩病。由于应用无病毒苗木，温州蜜柑萎缩病在田间发生分布很少。柑桔衰退病是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的一种重要病害，广泛分布于世界各柑桔产区，严重威胁着世界上以酸橙为砧木的柑桔产区和对CTV茎陷点株系敏感的葡萄柚、甜橙等品种的安全。柑桔裂皮病是由柑桔裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)引起的一种世界范围的重要柑桔病害，是限制我国柑桔产量的一种重要的嫁接传播性类病毒，主要为害以枳、枳橙和菜檬作砧木的柑桔品种，引起砧木部树皮开裂、植株矮化等症状，并导致病树落花落果严重，枯枝多，严重时全株死亡。柑桔碎叶病是由柑桔碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus，CTLV)引起的一种柑桔病害，主要危害以枳及其杂种作砧木的柑桔，我国浙江、广东、四川和重庆等省市均有此病的发生。柑桔黄龙病(HLB)是一种在柑桔生产上危害极其严重的类细菌病害，该病的亚洲种病原物为Candidatus liberobacter asiaticus，是我国南部柑桔产区的毁灭性病害，是国内植物检疫对象。柑桔这4种重要嫁接传播病原物在果园中经常以两种或两种以上病原混合侵染为害，危害轻者可引起树势衰退，产量下降，品质变劣；重者可引起成片柑桔树的死亡，对柑桔高产优质生产构成严重障碍。

传统的柑桔病毒病和类病毒病检测方法主要以指示植物鉴定，一般采用Etrog香橼作为指示植物鉴定CEVd，目前鉴定CTV采用墨西哥来檬和酸橙等5种指示植物，CTLV通常采用腊斯克枳橙作为指示植物进行鉴定，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。黄龙病病原物上世纪70年代电镜观察为诊断黄龙病的重要手段，但电镜的检出率较低。目前也有检测CTV和CTLV溃疡病病菌的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。而PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断。

但常规PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需进行多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。多重PCR(Multiplex PCR)是近几年兴起的一项新技术，该技术在同一反应管内同时加入多对引物，扩增完成后可同时检测出多种目的核酸片段，满足同时分析不同DNA序列的需要，它具有高效快捷、高度特异敏感、降低实验成本、加速实验进程等优点。

目前已建立了CTV、CEVd、CTLV的单一RT-PCR分子检测技术，建立了黄龙病的PCR技术，但尚未见4种重要嫁接传播病害的一步法多重PCR体系的报道。建立稳定灵敏的同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原一步法多重PCR检测技术体系，有利于摸清田间4种病害发生状况，实施柑桔多种病毒病和类病毒病的高效快速检测，同时利于加快茎尖嫁接脱毒苗的评价，推进引进品种和推广苗木的无毒化进程，确保柑桔安全生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确能同时检测柑桔4种重要嫁接传播病原的一步法多重PCR检测方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。

本发明的目的是这样实现的：

本发明选用已经报道柑桔嫁接传播病原的引物对，如下：

柑桔衰退病毒引物为：

上游引物：5’-ATGTCAGGCAGCTTGGGAAATT-3’

下游引物：5’-TTCGTGTCTAAGTCRCGCTAA CA-3’

柑桔裂皮病类病毒引物为：

上游引物：5’-GGAAACCTGGAGGAAGTCGAG-3’

下游引物：5’-CCGGGGATCCCTGAAGGACTT-3’

柑桔碎叶病毒引物为：

上游引物：5’-TGAAAACCTTTGCTGCCACTTCT-3’

下游引物：5’-TACTCTCCGAACCTGCCTCGA AA-3’

黄龙病病菌引物：

上游引物：5’-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3’

下游引物：5’-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3’