[发明专利]肝素双糖混合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.双糖混合物，其特征在于，在所述混合物中，含有肝素双糖1-8，肝素双糖1-8分别为：I-S，I-A，II-S，II-A，III-S，III-A，IV-S，IV-A。

2.根据权利要求1的双糖混合物，其特征在于，所述混合物为混合物1，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，47％；I-A，1.3％；II-S，18.9％；II-A，12.5％；III-S，3.7％；III-A，3.3％；IV-S，4.9％；IV-A，6.7％。

3.根据权利要求1的双糖混合物，其特征在于，所述混合物为混合物2，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，40.6％；I-A，5.7％；II-S，37.7％；II-A，1.2％；III-S，9.9％；III-A，2.3％；IV-S，1.7％；IV-A，0.98％。

4.根据权利要求1所述的双糖混合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、肝素样品用肝素酶I降解；

步骤2、对步骤1所得的降解产物中的二、四、六糖进行分离，得到二糖，四糖，六糖；

步骤3、步骤2中分离出的四糖和六糖均使用肝素酶II和肝素酶III降解；

步骤4、降解物分别用层析柱分离，分别分离出二糖和四糖；

步骤5、步骤4得到两种二糖混合物，即第一种混合物和第二种混合物。

5.根据权利要求4的方法，其中所述步骤1的降解作用可以在4℃～35℃下进行。

6.根据权利要求5的方法，其中所述步骤1的降解作用在室温下进行。

7.根据权利要求6的方法，其中所述步骤1的降解作用在室温下进行2-24小时。

8.根据权利要求4～7任一项的方法，其中在步骤2中，利用柱层析方法对步骤1中所得的降解产品进行分离。

9.根据权利要求8的方法，其中在步骤2中，使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)对步骤1中所得的降解产品进行分离。

10.根据权利要求4～9任一项的方法，其中所述步骤3的降解作用可以在4℃～35℃下进行。

11.根据权利要求10的方法，其中所述步骤3的降解作用在室温下进行。

12.根据权利要求11的方法，其中所述步骤3的降解作用在室温下进行6-24小时。

13.根据权利要求4～12任一项的方法，其中在步骤4中，使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)进行分离。

14.根据权利要求4～13任一项的方法，包括以下步骤：

步骤1、取肝素样品，溶于Tris-HCl缓冲液中，加入肝素酶I，在室温下，酶解2-24小时；

步骤2、取步骤1中获得的降解产物，上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以碳酸氢铵溶液平衡并洗脱，分部收集，先后得到六糖、四糖、双糖，将四糖和六糖分别汇合收集，浓缩；

步骤3、向步骤2获得的四糖和六糖组分中，分别加入肝素酶II和肝素酶III，在室温下，酶解6-24小时；

步骤4、将步骤3中获得的降解物上Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以碳酸氢铵溶液平衡并洗脱，分部收集，先后得到四糖和双糖；

步骤5、步骤4得到二糖混合物，分别汇合收集，旋转浓缩，冷冻干燥，得到本发明的第一种双糖混合物和第二种双糖混合物。

15.一种检测肝素双糖作用酶的存在的方法，所述肝素双糖作用酶为肝素双糖脱硫酸酶或肝素双糖双键消除酶，或其它能以肝素双糖为作用底物引起可检测变化的酶，所述方法包括：

1)将权利要求1～3任一项的双糖混合物配成1-10mg/ml溶液；

2)向步骤1的溶液中加入可能含有肝素双糖作用酶的物质，室温反应6-24小时；

3)用上述SAX-HPLC法测定步骤2)反应后的双糖图谱，对比步骤1)中使用的双糖混合物的SAX-HPLC图谱，观察各成分的色谱峰面积变化，进行判定。

16.根据权利要求4～14任一项的方法获得的双糖混合物。

17.根据权利要求16的混合物，其为混合物1、混合物2或者二者的混合物。