[发明专利]肝素双糖混合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及肝素双糖混合物，其制备方法，使用该双糖混合物作为标准物质对肝素或者低分子量肝素进行HPLC分析的方法，以及所述双糖混合物的应用。

背景技术

肝素(heparin)是一种糖胺聚糖类天然药物，于1916年被Mclean发现具有抗凝血功能。1935年开始用作临床抗凝药物，成为仅次于胰岛素的第2大天然产物药物。广泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇，抗平滑肌增生、促进纤维蛋白溶解等作用。

肝素的化学本质是长短不一的酸性粘多糖长链的混合物，由硫酸化或乙酰化不同的己糖醛酸(UA)和葡萄糖胺(GlcN)双糖单位交替连接构成，形成分子量4～40kDa的糖链混合物。

为了从肝素源中产生低分子量肝素，必须将较长的肝素多糖链打断成较短的低分子量链。这一过程可以通过化学或酶的解聚作用来进行。

将肝素用酶法或β消除法充分分解为双糖时，主要产生8种双糖：

α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS-6S(I-S)

α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNAc-6S(I-A)

α-ΔUA-[1→4]-GlcNS-6S(II-S)

α-ΔUA-[1→4]-GlcNAc-6S(II-A)

α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS(III-S)

α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNAc(III-A)

α-ΔUA-[1→4]-GlcNS(IV-S)

α-ΔUA-[1→4]-GlcNAc(IV-A)

这8种双糖在猪肠黏膜或其它来源的肝素和低分子肝素中的含量大致保持恒定，利用这一点，通过分析双糖组成可以判断肝素或低分子肝素的来源，也可分析生产中的批次间差异。

以SAX-HPLC法测定肝素或低分子肝素中的双糖种类和含量比例，可作为一种质量是否合格的检测手段。由于所用SAX-HPLC柱会在使用过程中渐渐因柱效下降而引起双糖出峰位置漂移，这会对双糖成分的判断带来干扰，需要在每次使用前先以标准双糖来标定出峰位置；并且，由于其中I-S含量过高，会掩盖其他弱势峰是在HPLC图谱上如果有某个组分峰极高大时，其他组分峰在图上就太弱小以至于接近基线而像是噪音峰，不利于对其他双糖含量进行分析。

本申请的发明人经过长期研究发现，通过本发明方法生产的双糖混合物中不仅含有上述8种标准肝素双糖，而且这8种双糖的比例比较温和，使用本发明双糖混合物作为HPLC分析中的标准物质时，8个标准物的峰都能比较明显地辨别出。在每次测定前均先用此混合双糖做标定，则每次测定目标物的双糖组分能确定辨别。

并且，本发明中的标准双糖混合物，不但可以用做HPLC分析时的标准，还可以用来检测以肝素双糖为作用底物的酶如肝素双糖脱硫酸酶、肝素双糖双键消除酶等的存在。在肝素酶中有时会含有这两种杂质酶，其存在会导致肝素酶作用的最终产物被继续作用，从而影响肝素酶降解反应后的色谱分析。所以在使用前对肝素酶中是否含有这二种杂质酶做检测是很重要的。

与现有技术中的相关方法相比，本发明简单易操作，具有极高的实际使用价值。

本发明提出一种标准双糖混合物的制备方法，通过将肝素先用肝素酶I充分降解为二糖、四糖、六糖混合物，取其中的四糖和六糖，再分别以肝素酶II、III联合充分降解，分离出产生的双糖，这样得到两种混合双糖，均含所有8种前述标准肝素双糖，而且这8种双糖的比例比较温和。可以使用这二种混合双糖之一或其混合物，作为HPLC分析的标准物质。

因此，本发明方法的创新点之一在于先用肝素酶I充分作用肝素，将肝素中含量过高的I-S双糖除掉大部分，这样获得的双糖混合物色谱图上不致因I-S峰过于高大而掩盖其他弱势双糖峰；另外将这样的双糖混合物用于检测肝素双糖脱硫酸酶、肝素双糖双键消除酶等为本发明首创。

发明内容

在本发明的一方面中，本发明提供了一种标准双糖混合物，在所述混合物中，含有肝素双糖1-8，肝素双糖1-8分别为：I-S，I-A，II-S，II-A，III-S，III-A，IV-S，IV-A。。

在本发明的另一方面，本发明提供了如上所述的标准双糖混合物的制备方法，所述方法包括：

步骤1、肝素样品用肝素酶I(编号EC 4.2.2.7.)降解；

步骤2、对步骤1所得的降解产物中的二、四、六糖进行分离，得到二糖，四糖，六糖；