[发明专利]一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法

权利要求书

1.一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤：

A、将0.1ml病毒滴度为1.0×10⁶~1.0×10⁷的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种；

B、接种后1周，取5ml豚鼠血液与5ml RPMI 1640培养基混匀，加于10ml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min，使细胞分为四层；

C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI 1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集；

D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入1ml TRIZOL，常温静置1h，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min，4℃ 13500r/min离心15min，取上层液并加入等体积异丙醇，混匀，静置10min，4℃ 13500r/min离心10min，去上清，向沉淀物中加入1ml -20℃预冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4℃，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNase free dH₂O溶解，得到总RNA；

E、采用20μL反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA；

F、以cDNA为模板用Nested-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；

G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。

2.如权利要求1所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤E的反应体系包括：MgCl₂,4μl；Reverse Transcription 10X Buffer，2μl；dNTP Mixture，2μl；Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor，0.5μl；AMV Reverse Transcriptase，15u；Oligo(dT)₁₅ Primer，0.5μg；total RNA ，1μg；Nuclease-Free Water补至20μl；反应条件为：42°C 15 minutes, 95°C 5 minutes,，4°C 5 minutes；使用β-Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量。

3.如权利要求1所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤F的Nested-PCR扩增为：取2μL cDNA加入到48μL PCR反应体系中，EBNA1第一轮PCR程序： 94℃预变性2min，94℃热变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸5min；第二轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃热变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min；BcLF1第一轮PCR程序：94℃预变性2min，94℃热变性1min，64℃退火1min，72℃延伸2min，40个循环，72℃延伸5min；第二轮PCR程序：94℃预变性1min，94℃热变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸5min，经Nested-PCR扩增后产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片。

4.如权利要求1所述的EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤F的Nested-PCR扩增中的引物核酸序列为：

目的基因为EBNA1的引物序列：

F1：5’-TCTGGAGCCTGACCTGTGAT-3’，

R1：5’-CTCCTCGTCCTCGTCCTCTT-3’；

F2：5’-ATAGACCGCCAGTAGACCTG-3’，

R2：5’-GGTTATCACCCCCTCTTCTT-3’； 

目的基因为BcLF1的引物序列：

F1：5’-TATGCCCAATCCCAAGTACACG-3’，

R1：5’-TGGACGGGTGGAGGAAGTCTTC-3’ 

F2：5’-ACACAGCAGCTACCGGTGGA-3’， 

R2：5’-TGTTGCAGGGAGTAGGTCTC-3’

目的基因为β-Actin的引物序列：

F：5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’ 

R：5’-GCTAGAAGCATTTGCGGTGCTCGATGGAGG-3’。