[发明专利]一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种动物模型的建立方法，特别涉及一种豚鼠EB病毒动物模型的建立方法，属于医学生物学技术领域。 

背景技术

EBV病毒的全称为Epstein-Barr virus，是由epstein和barr于1964年首次成功地使用burkitt非洲儿童的淋巴瘤细胞，通过体外悬浮培养而建立的病毒株。EBV在人群中具有普遍感染性，在全球范围内，有90%以上的人被EBV感染过。EBV主要通过唾液传播，也可经血液传染。感染多发生在幼儿时期，一般不伴随或只伴随较弱的临床症状。EBV的感染能够诱导多种恶性肿瘤的产生，包括伯基特淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤等，并常与其他病毒感染相关联，如HIV。目前还没有有效治疗EBV感染的药物，对因EBV感染而引起的致癌，目前还得不到有效地防治或治疗。而为了治疗EBV相关疾病，必须更深入地研究EBV，这就需要建立一种便于研究EBV的动物模型。自EBV被发现至今，在已公开的EBV动物模型中，只有少数的几种灵长类动物对EBV最为易感，但随着灵长类动物数量的急剧减少，以及灵长类动物价格的不断飙升，昂贵的灵长类动物模型实验已不能再继续，严重制约着人们对EBV的进一步深入研究。因此，有必要研发新的、实用的、有效的动物实验模型，以对EBV进行更加深入的研究，最终获得能够治疗EBV感染的药物，防治因EBV感染而引起的各种癌症。 

豚鼠是一种常见的实验动物，已广泛应用于传染病研究，且对多种病毒易感，同时容易饲养、性格温顺、体积小巧，很适合实验操作。 

发明内容

针对现有EBV病毒动物模型只对少数几种灵长类动物易感，而灵长类动物又因数量少、价格昂贵以及维系生态平衡等诸多因素，不再继续使用，从而制约着人们对EBV的深入研究，进而难于获得治疗EBV感染的药物，不能防治由EBV感染而引起的各种癌症，等诸多问题，本发明提供一种对EBV最为易感，并能用豚鼠取代灵长类动物的EBV病毒动物模型及其建立方法。 

本发明通过下列技术方案完成：一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤： 

A、将0.1ml病毒滴度为1.0×10⁶~1.0×10⁷的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种；

B、接种后1周，取5ml豚鼠血液与5ml RPMI 1640培养基混匀，加于10ml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min，使细胞分为四层；

C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI 1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集；

D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入1ml TRIZOL，常温静置1h，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min，4℃ 13500r/min离心15min，取上层液并加入等体积异丙醇，混匀，静置10min，4℃ 13500r/min离心10min，去上清，向沉淀物中加入1ml -20℃预冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4℃，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNase free dH₂O溶解，得到总RNA；

E、采用20μL反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA；

F、以cDNA为模板用Nested-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；

G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。

所述步骤E的反应体系包括：MgCl₂,4μl；Reverse Transcription 10X Buffer，2μl；dNTP Mixture，2μl；Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor，0.5μl；AMV Reverse Transcriptase，15u；Oligo(dT)₁₅ Primer，0.5μg；total RNA ，1μg；Nuclease-Free Water补至20μl；反应条件为：42°C 15 minutes, 95°C 5 minutes,，4°C 5 minutes；使用β-Actin基因做内参用于评价提取的RNA质量。