[发明专利]抗痘苗病毒IgY抗体的制备

权利要求书

1.一种抗痘苗病毒VACA(Vaccinia virus，VACA)卵黄抗体IgY的制备，其特征在于：所述抗VACA卵黄抗体经斑点免疫吸附实验(Dot ImmunobindingAssay，DIBA)证明可以和VACA抗原发生特异性结合反应；免疫电镜(immunoelectron microscopy，IEM)观察，金标抗VACA卵黄抗体可以特异性结合VACA病毒粒子表面；免疫印记(western blot，WB)分析，卵黄抗体在100KDa处可特异性结合痘苗病毒，呈现特异性染色；间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence，IFA)测定滴度，卵黄抗体在第3次加强免疫后，及第21周达到最高；50％斑点中和试验(plaque reduction neutralization test，PRNT₅₀)表明，第二次加强免疫后，中和抗体滴度达到最大；抗体滴度达到最高时，将IgY结合到磁珠，浓缩不同稀释倍数的痘苗病毒，浓缩的病毒量使用实时荧光PCR检测其含量，当病毒含量达到5PFU/ml时，其回收率达到35.4％。

2.一种制备抗痘苗病毒卵黄抗体，即抗-VACA IgY的方法，其特征在于采用如下的工艺步骤：

(1)VACA抗原的制备

a)：VACA多次接种11日龄鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，孵育4天后，超速离心，悬于PBS缓冲液；

b)：斑点实验测定VACA滴度，福尔马林灭活，贮存-70℃备用。

(2)免疫方法

初次免疫用费氏完全佐剂乳化的抗原肌肉注射免疫16周龄白色来航鸡，免疫剂量400μg；初免后36天二免，使用费氏不完全佐剂，免疫剂量400μg；72天后三免，免疫剂量2000μg；148天四免，免疫剂量1000μg；319天五免，免疫剂量2000μg；389天六免，免疫剂量2000μg，每日收集鸡蛋，做标记，4℃保存。

(3)IgY的纯化

IgY的分离和纯化采用聚乙二醇沉淀法，方法如下：

a)：分离卵黄和卵清，收集卵黄，将卵黄使用PBS(pH7.4)按照1∶2进行稀释；

b)：加入3.5％(W/V)的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用10min；

c)：离心(14,000g，4℃，20min)，收集上清，过滤，滤液加入12％(W/V)PEG-6000，离心(14,000g，4℃，20min)；

d)：弃去上清液，沉淀使用10ml的PBS(pH7.4)悬浮，加入加入12％(W/V)PEG-6000，离心(14,000g，4℃，20min)；

e)：沉淀使用1.2ml PBS溶解后，使用透析带(截留量80000-140000)进行透析，PBS(pH7.4)透析3次。