[发明专利]抗痘苗病毒IgY抗体的制备

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域中的一种特异性卵黄抗体(egg yolk antibody，IgY)的制备和应用，特别涉及抗痘苗病毒IgY抗体的制备方法及其该抗体用于痘苗病毒免疫诊断试剂的用途。 

背景技术

痘苗病毒(Vaccinia Virus，VACA)属于正痘病毒属(Orthopoxvirus)成员，可以作为疫苗预防天花，同时可以作为实验用痘病毒的模型。痘苗病毒自然状态下可在家畜和实验动物中传播，引起牛的乳头感染以及免疫。痘苗病毒也可造成人的感染，尤其对危险人群(如孕妇、免疫缺陷者、皮肤病患者)感染可导致严重的并发症。人接种痘苗病毒疫苗后可获得对天花病毒的免疫力，但随着天花病在全球的灭绝，痘病毒疫苗已在很多国家和人群中放弃使用。由于人畜密切接触等多种原因，目前在人和相关动物物种中，正痘病毒的感染与发病呈明显上升趋势，获得有关痘病毒的抗体及其检测试剂对于在人类医学与兽医中该病原体的诊断与中和性治疗具有重要意义。 

IgY抗体是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50～100mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。与哺乳动物IgG相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG， 且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7-7.6之间，在pH4.0～11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4℃储存6～7年活性下降仅5％(Jaradat ZW，Marquardt R R.2000.Studies on the stability of chicken IgY in different sugars，complex carbohydrates and food materials.Food andAgricultural Immunology，12(4)：263-272)；IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强(Shimizu M，Nagashima H，Sano K，et al.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G. Biosci Biotechnol Biochem，56(2)：270-274)。由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，卵黄抗体应用于检测也具有多方面的优势如：卵黄抗体与风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种抗VACA卵黄抗体的制备方法。 

本发明的第二个目的是提供制备的抗VACA-IgY对VACA感染的体外中和作用。 

本发明的第三个目的是提供将制备的抗VACA-IgY抗体偶联免疫磁珠的方法，以便对含VACA的检测物进行富集，用于检测VACA。 

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术方案： 

1抗VACA卵黄抗体的制备方法 

(1)抗原制备 

a：VACA多次接种龄鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，孵育后，超速离心，悬于PBS缓冲液； 

b：福尔马林灭活VACA，贮存-70℃备用。 

(2)免疫方法 

初次免疫用费氏完全佐剂乳化的抗原肌肉注射免疫16周龄白色来航鸡，免疫剂量400μg；初免后36天二免，使用费氏不完全佐剂，免疫剂量400μg；72天后三免，免疫剂量2000μg；148天四免，免疫剂量1000μg；319天五免，免疫剂量2000μg；389天六免，免疫剂量2000μg。每日收集鸡蛋，做标记，4℃保存。