[发明专利]一种捕获探针的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物样品的制备与处理，更具体地说，涉及一种捕获探针的制备方法及其应用。

背景技术

后基因组时代，对特定片段的序列和功能的了解的需求日益迫切。现有技术中，对于核酸片段的获取，主要通过微阵列技术捕获核酸片段，其基本原理如下：在微阵列芯片上合成用于捕获核酸片段的DNA捕获探针，或是将DNA转变成RNA制备成捕获探针，然后将捕获探针与片段化之后得到的源核酸片段孵育结合，捕获目标核酸片段。该技术中，捕获探针的生物素标记是由带生物素标记的碱基带入，生物素标记的数量和位置是未知不确定的；而且该微阵列技术所用的DNA捕获探针直接在芯片上合成，生产成本高；此外，由于捕获探针的设计只针对不连续的外显子区域，因此只能捕获外显子区域核酸片段，适用的范围窄，对于外显子区域以外的核酸片段无法捕获。

因此，迫切需要一种新的捕获探针的制备方法，能够对捕获探针所带的生物素标记的数量和位置进行控制，能够降低生产成本，同时适用范围广，制得的捕获探针可以针对任意目标区域而不仅仅是外显子区域的核酸片段进行捕获。

发明内容

本发明的目的在于提供一种捕获探针的制备方法，同时提供该捕获探针在捕获核酸片段以及测序中的应用方法，旨在解决现有技术中捕获探针的生物素标记数量和位置不确定，生产成本高以及适用范围窄的问题。

为了实现发明目的，所述捕获探针的制备方法包括以下步骤：

A.根据待捕获核酸片段的核酸序列信息，得到至少一个带有插入片段的DNA克隆载体；

B.以DNA克隆载体为原料，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件制备捕获探针。

其中，所述步骤A中DNA克隆载体，当其数量大于等于2时，则DNA克隆载体所包含的各插入片段之间叠加后能形成完整的待捕获核酸片段。

优选的，所述步骤B利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物制备捕获探针，包括以下步骤：

B1.片段化处理DNA克隆载体，得到DNA克隆载体片段；

B2.在DNA克隆载体片段两端接上接头，得到带接头的DNA克隆载体片段；

B3.利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物对带接头的DNA克隆载体片段进行扩增，得到扩增产物；

B4.分离提纯扩增产物，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

优选的，所述步骤B利用生物素化标记数量和位置确定的接头元件制备捕获探针，包括以下步骤：

B1’.通过DNA克隆载体培养增殖，得到足量的DNA克隆载体群；

B2’.片段化处理DNA克隆载体群，得到DNA克隆载体片段；

B3’.在DNA克隆载体片段两端接上生物素标记数量和位置确定的接头元件，得到带生物素标记接头的DNA克隆载体片段；

B4’.分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，得到生物素标记数量和位置确定的捕获探针。

其中，上述两种优选实现方式中，所述DNA克隆载体片段的大小优选在100-1000bp之间。

优选的，所述分离提纯扩增产物或分离提纯带生物素标记接头的DNA克隆载体片段，通过表面带有链霉亲和素或亲和素修饰的微珠实现。

更优选的，所述微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。

其中，若上述步骤A中的DNA克隆载体数量大于等于2时，则插入片段相互之间叠加能形成完整的待捕获核酸片段。

为了更好的实现发明目的，所述一种基于上述方法制备的捕获探针进行核酸片段捕获的方法包括以下步骤：

M1.片段化处理源核酸得到源核酸片段库；

M2.利用基于上述方法制备的捕获探针与源核酸片段库混合杂交，捕获目标核酸片段。

其中，所述步骤M1中源核酸片段大小在100-1000bp之间。

优选的，所述步骤M1还包括对得到的源核酸片段库进行扩增的步骤。

优选的，所述步骤M2之后还包括步骤：

M3.变性解离捕获的目标核酸片段，形成片段文库。

为了进一步阐述本发明的意义，本发明还提供一种利用上述方法所捕获的核酸片段进行基因测序的方法，所述方法包括以下步骤：

P1.利用上述方法所捕获的核酸片段形成的片段文库中加入引物进行扩增，得到捕获片段扩增产物；

P2.分离提纯捕获片段扩增产物，形成测序文库；

P3.利用测序文库进行测序，得到所捕获核酸片段的基因序列。

其中，所述步骤P1中的引物是带生物素标记的扩增引物。