[发明专利]吉他霉素残留检测用单克隆抗体及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体，同时还涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，还涉及一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的用途。 

背景技术

吉他霉素属于大环内酯类抗生素，广泛用于猪和禽的生产。不正确的使用会导致其在动物体内的残留，导致消费者+使用后出现一系列不良反应。主要有轻微的胃肠道反应如腹泻、恶心、呕吐、过敏、肝毒性、耳鸣、听觉障碍和心脏毒性等(舒刚等，2006)。吉他霉素残留还会引起人体内细菌产生耐药性，直接影响人类疾病治疗(Deguchi et al.，1990；刘秀昌和赵学良，2009)。Nakae等在临床样本细菌耐药性实验中证实，临床细菌吉他霉素耐药很严重，97.6～100％临床分离菌株对其耐药(Nakae et al.，1999)。 

考虑到吉他霉素的危害，我国规定其在猪和鸡各组织的残留限量均为200μg/kg(中华人民共和国农业部公告第235号，2002)。各种吉他霉素制剂在猪和鸡的休药期均为7d，产蛋鸡禁用(中华人民共和国农业部公告第278号，2003)。日本肯定列表制度规定吉他霉素在猪、鸡各组织的最高残留限量均为200μg/kg(日本肯定列表，2006)。 

现有的吉他霉素检测方法主要是高效液相色谱方法和高效液相色谱方法与质谱联用方法(He et al.，2009；Gonzalez Huebra MJ et al.，2005，2007；Horie et al.，1998，2003)。仪器检测方法测定结果准确，而且能够对残留物质进行定性分析，是残留检测的确证方法。但仪器方法样品处理一般比较复杂、耗时长、所用仪器成本高，很难在基层普及。ELISA检测方法具有简便、快速、低成本和高通量的特点，适合样品的广泛筛选。目前尚未检索到关于吉他霉素特异性抗原、抗体、酶联免疫方法和试剂盒的报道。制备吉他霉素的单克隆抗体、建立ELISA检测方法和试剂盒，有利于监控吉他霉素的残留。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体，该抗体是首次制备的能特异性识别吉他霉素的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，该方法是由半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联制备的免疫原免疫小鼠，经细胞融合与克隆筛 选后，获得了能特异性分泌吉他霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株KA/2A9，CCTCCNO：C201184。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测的试剂盒，该试剂盒能广泛应用于动物可食性组织中吉他霉素的残留检测，准确提供动物可食性组织中吉他霉素的残留量信息 

本发明的再有一个目的是在于提供了一种吉他霉素残留检测试剂盒在动物源性食品中吉他霉素残留检测中的应用。为动物源性食品中吉他霉素的残留监控提供了可靠地技术手段。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

一种能识别吉他霉素的单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞株KA/2A9，CCTCC，NO：C201184。 

上述杂交瘤细胞KA/2A9，保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：C201184。 

所用的免疫原是由半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联制备的。 

进一步，本发明提出了一种适用于吉他霉素残留检测的酶联免疫(ELISA)方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的前处理等步骤，一种吉他霉素残留检测用单克隆抗体的制备方法，其步骤是： 

A、将半抗原吉他霉素与牛血清白蛋白偶联得到免疫原； 

B、将半抗原吉他霉素与卵清蛋白偶联得到包被原； 

C、利用步骤A的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO：C201184杂交瘤细胞株KA/2A9所分泌的单克隆抗体； 

D、用步骤B的包被原包被固相载体(如酶标板)； 

E、将待测样品用偏磷酸/乙醇下提取、乙酸乙酯反萃取，氮气吹干、样品稀释液重新溶解得到待测物； 

F、对步骤E的待测物进行酶联免疫检测； 

步骤E样品稀释液的组分及配比为：NaCl 8.00g，KH₂PO4 0.20g，Na₂HPO4·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，加双蒸水定容至1000mL。