[发明专利]一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用

说明书

本申请为发明名称为“一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用”、申请号为201010527409.0、申请日为2010年10月29日的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

含有特定功能基团的光学活性手性醇是合成医药、农药及其它精细化学品的重要手性砌块。研究人员已开发出多种光学活性手性醇合成的方法，包括动力学拆分和不对称合成。其中，利用前手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性醇的途径，可实现理论100％的产率，是生产光学活性手性醇的重要方法。化学家们已经发现手性金属化合物可作为催化剂用于羰基的不对称还原，尽管该化学方法已被用于工业生产，然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因此其应用受到限制。生物催化方法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处，因此近几年来生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

氧化还原酶是催化生物氧化/还原反应的一大类酶，被广泛应用于不对称合成光学活性手性药物和功能性类固醇等化合物，因此开发具有实际应用价值的氧化还原酶一直是生物技术领域的一项重要内容。醛酮还原酶(AKR)和短链醇脱氢酶(SDR)是羰基还原酶家族的两大重要超家族。其中AKR超家族可分成15个家族，包含约150个成员。相比而言，SDR超家族成员数目较为庞大，目前已有46000多个成员。醛酮还原酶多为NADPH依赖型，通常为单亚基结构，亚基大小一般在35～40kDa左右；而短链醇脱氢酶多数由双亚基或四个亚基组成，亚基大小一般在27kDa左右。还原酶来源十分广泛，在微生物中普遍存在。例如，面包酵母全基因组中包含49个编码还原酶的开放读码框，其中18个还原酶的基因已被克隆表达并用于酮酯的不对称还原(J.Am.Chem.S℃.，2004，126：12827-12832)。另外，从许多其它微生物中也分离得到了具有立体选择性的还原酶，有些被进一步克隆表达，并应用于生物催化领域。例如，Kita等(J.Mol.Catal.B：Enzym.，1999，6：305-313)从掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)AKU4429中分离得到三种可催化4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原的还原酶；Itoh等(Appl.Microbiol.Biotehnol.，2004，66：53-62)对青霉菌(Penicillium citrinum)IF04631中的一种β-酮酯还原酶(AKR3E1)进行了异源表达，并应用于(S)-4-溴-3-羟基丁酸甲酯的生产中。

然而目前应用于工业的还原酶类催化剂所占的比率尚不足总量的14％。如何针对特定的底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。将生物信息学和基因重组技术相结合，快速高效地开发性能优异的新型生物催化剂，是发展生物不对称还原技术的有效途径。Yamamoto等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，2003，61：133-139)利用该手段克隆了来自枯草芽孢杆菌中的重组还原酶FabG以及其他多种微生物中的FabG结构类似酶，用以催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原。另外，其它一些来自枯草芽孢杆菌的还原酶的结构和性质也已有研究报道。如枯草芽孢杆菌还原酶YtbE对多种醛类化合物有还原活性(Protein Science，2009，18：1792-1800)；还原酶YueD对联苯甲酰有还原活性(J.Biotechnol.，2002，96：157-169)。但这三种来自枯草芽孢杆菌的还原酶是否可以用于催化其他羰基化合物的不对称还原，迄今尚无文献报道。

目前已知芽孢杆菌(Bacillus sp.)ECU0013，即CGMCC No.2549可催化多种芳基酮不对称还原生成光学活性手性仲醇(Bioresour.Technol.，2010，101：1054-1059；发明专利CN101372677B)。但是以该野生菌株整细胞作为催化剂时，由于酶产量很低，导致总体催化活性不高，从而限制了生物催化剂的优势发挥。

发明内容