[发明专利]中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。 

背景技术

抗菌肽（Antibacterial Peptides，ABP）是由胚系基因编码的内源性活性肽分子，广泛存在于多种生物体内，是生物体对外界病原物入侵感染而产生的一系列免疫反应的产物。由于其分子量小，极易扩散到感染部位，不存在使用后产生耐药性的问题，且进入机体后无有害残留，因此，抗菌肽在畜禽养殖业上的研究与应用，将是实现健康养殖、消除抗生素残留的重要措施。鲎是一种极其珍贵的海洋无脊椎动物，也是海洋动物界现存的“活化石”，其经济价值和科研价值很高。鲎缺乏获得性免疫系统，在抵抗病原侵袭的过程中形成了多种天然防御系统，在这些防御系统中，鲎素（Tachyplesin）发挥了主要的抗病原作用。鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽，它的发现被医学界称为“抗生素”研究的一个里程碑，是后抗生素时代到来的标致。 

1969年，Koichi Ogata首次发现了一种可以利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌^[ ]。甲醇可以很廉价的从天然气中合成，因此立即引起人们将毕赤酵母开发成动物高蛋白饲料的兴趣。20世纪70年代，Phillips Petroleum Company研制了毕赤酵母单细胞蛋白（SCP）的培养基及连续高密度培养方法（<130 g/L 细胞干重）。进入80年代，Salk Institute Biotechnology/Industrial Associate Inc.（SIBIA）将毕赤酵母开发为异源蛋白表达系统，并构建了载体、菌株及毕赤酵母的基因工程操作方法。沿用SCP生产中使用的培养基及发酵方法，联合AOX1启动子的调控，实现了外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。1993年，授权Invitrogen Company向全世界出售该系统，推动了毕赤酵母表达系统的发展和应用。到目前，已用毕赤酵母表达系统成功的表达了200种以上的蛋白，毕赤酵母还被美国食品和医药管理局（Food and Drug Administration，FDA）确认为是一种安全的生物，具有良好的生物安全性。1997年开发的P.pastoris的组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（Glyceraldehydes–3-phosphate dehydrogenase，GAP）启动子，该启动子是组成型表达的，所以不存在诱导的问题，在以葡萄糖为碳源的培养基上就可以表达，从而有利于产品的生产和应用，且表达量较诱导型高。目前，该系统还很少应用于抗菌肽的表达，预期将该系统引入抗菌肽的表达，能够成为抗菌肽规模化生产的最佳途径。 

发明内容

本发明的目的是采用微生态理论和分子生物学技术，将中国鲎抗菌肽Tachyplesins I（TP I）基因克隆到组成型表达载体pGAPZα A中，构建鲎素抗菌肽基因GAP启动子酵母表达载体。 

本发明首先根据tachyplesins基因的测序结果设计引物TP I-NNX1和TP I-NNX2，含如下酶切位点： 

上游引物TP I-NNX1：5’-CCGC|TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3’

Xho I

下游引物TP I-NCX2：5’-GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3’

Xba I

然后根据pGAPZα使用手册合成通用引物：

上游引物5’ pGAP：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’

下游引物3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’

对TP I基因的克隆质粒pMD-18T-TP I和酵母表达载体pGAPZα A进行双酶切，回收酶切目的片段，用T₄ DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性转化子，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定，并进行测序。

本发明由上述方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体pGAPZα A-TPI。