[发明专利]氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒载体，特别涉及一种氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建方法，以及其在制备大肠杆菌菌蜕中的用途，属于基因工程领域。

背景技术

细菌菌蜕(Bacterial ghost)是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整细菌空壳，这种非变性的基因灭活方式使菌蜕保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，从而诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。菌蜕外膜的天然的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如：脂多糖、肽聚糖、CPG、菌毛等，能被免疫细胞通过模式识别受体识别，有效地被树突状细胞和巨噬细胞吞噬，并有效地促进树突状细胞的成熟和活化。菌蜕的这些生物学特点使其可直接作为疫苗使用，还可作为递呈异源抗原的重组疫苗及作为DNA疫苗甚至药物的递送载体。另外，菌蜕可以通过发酵方式生产，且冷冻干燥的菌蜕在室温下可长期保持，而不会造成效率的损失。

细菌菌蜕的形成是通过对噬菌体PhiX174的裂解基因E的严格表达调控实现的。裂解基因E可以受控于多个表达系统，如λpL/pR-cI857、LacPO-LacI^q(启动与阻隔物)、P_Tol-xylS以及P_BAD-araC等，其中应用最广泛的是在λpL/pR-c1857转录控制下实现基因的可控表达。基因E的可控表达介导的细菌裂解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽门螺旋杆菌、胸膜肺炎放射杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、迟钝爱德华菌、鳗弧菌、嗜水气单胞菌等。应用范围之广说明只要将基因E裂解框引入到适当的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每种革兰氏阴性菌中发生。

目前已经构建的基因E介导的裂解质粒多数利用氨苄青霉素作为抗性筛选标记，还有一些具有卡那霉素、四环素或庆大霉素抗性筛选标记。由于细菌耐药性现象越来越常见，许多细菌对氨苄青霉素、卡那霉素等常用抗生素产生耐药，无法利用这些抗生素作为筛选标记。但许多病原菌如副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌O157、变形杆菌、沙门菌、志贺菌等均对氯霉素敏感，还有大多数水生生物病原菌如柱状嗜纤维菌、柱状粘纤维菌、荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、点状气单胞菌、杀鲑气单胞菌及鲁克氏耶尔森氏菌等均对氯霉素敏感或者高度敏感。因此，利用氯霉素作为抗性筛选标记能使E蛋白介导的裂解应用到更广泛的细菌菌株中。构建氯霉素抗性的温控裂解质粒是许多病原菌能够成功形成菌蜕的前提。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种新的氯霉素抗性温控裂解质粒，并提供了其构建方法，以及其在菌蜕制备中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat，由噬菌体PhiX174裂解基因E(如SEQ No.3所示)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat，如SEQ No.4所示)和原核温控表达载体pBV220组成。

所述氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat的构建方法为：以噬菌体PhiX174 RFI DNA为模板、SEQ No.1和SEQ No.2所示DNA为引物进行PCR扩增，获得噬菌体PhiX174裂解基因E，然后将其与经EcoR I和Pst I双酶切的pBV220载体连接，获得温控裂解质粒pBV-geneE；将质粒pLysS经Acc II酶切，获得1787bp的包含侧翼调控序列的cat基因，然后用T4 DNA ligase将cat基因与经Sca I单酶切的pBV-geneE进行连接，获得氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat。

所述氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat能够用于制备菌蜕，具体应用方式举例如下：将氯霉素抗性温控裂解质粒pBV-geneE-cat电击转化到大肠杆菌感受态细胞中；电转化后涂布含氯霉素的LB琼脂平板，培养，通过菌落PCR鉴定转化子；然后，将转化成功的含pBV-geneE-cat的大肠杆菌单克隆接种于含氯霉素的LB液体培养基，振荡培养，然后再转接于含氯霉素的LB液体培养基中，振荡培养至OD_600nm达0.4-0.6，将培养物迅速调至42℃培养以诱导E基因的表达，继续培养，即得大肠杆菌菌蜕。