[发明专利]一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种孔雀石绿半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其酶联免疫定量检测方法，属于免疫学范畴。

背景技术

孔雀石绿(Malachite green，MG)分子式为：C₂₃H₂₅N₂Cl，分子量365，电离常数pK值为6.9。pH值为4.0时，全部电离，pH值为6.9时50％电离，pH为7.4时，有25％电离，pH上升为10.1时，则不发生电离。

自1993年证实孔雀石绿具有抗菌杀虫等药效以来，许多国家曾广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫、原生动物和鱼卵中的霉菌等。在鱼类养殖中使用防治鱼类的水霉病等。在治疗鱼体和鱼卵体表传染病的药物中，很少有其它化学药物可与其效果相媲美，特别是治疗那些由水霉和多子小瓜虫引起的疾病。孔雀石绿的抗菌杀虫机理是：孔雀石绿在细胞分裂时阻碍蛋白肽的形成，使细胞内的氨基酸无法转化为蛋白肽，使细胞分裂受到抑制，从而产生抗菌杀虫作用。

孔雀石绿等进入人类或动物机体后，通过生物转化可产生致癌、致畸、致突变等副作用。美国食品药品管理局将孔雀石绿作为致癌敏感化合物。孔雀石绿对呼吸系统酶有毒性影响，可导致虹蹲鱼和罗非鱼的呼吸失调。孔雀石绿可在环境中长期存在并对水生和陆生生物产生毒性。临床报道和试验研究都证明孔雀石绿对多器官有毒性。孔雀石绿影响食物的吸收、动物生长和繁殖能力。造成肝、脾、肾和心的病变，皮肤、眼睛、肺部和骨骼的损害。

鉴于孔雀石绿的危害性，许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物。但由于孔雀石绿的抗菌果较好，价格便宜，不少业户在一段时间内仍可能偷偷使用，在国内市场的检查中也屡屡看到孔雀石绿的残留问题，尤其是河南、湖北等地的水产养殖和水产品运输过程中，孔雀石绿仍在被普遍使用。2002年12月农业部对农牧发【1999】17号文《动物性食品中兽药残留限量》进行了重新修订(235号公告)其中规定孔雀石绿为不得检出。

目前对孔雀石绿的检测方法主要有：薄层色谱法、分光光度法、共振瑞利散射法、气质联用法、高效液相色谱法和酶联免疫法等，目前国内尚无关于孔雀石绿的系统检测方法，该方法的建立为监控动物源性食品中孔雀石绿残留提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种孔雀石绿半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

本发明提供的孔雀石绿半抗原，是式(1)所示化合物：

式1

本发明还保护式(1)所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)于25mL三角瓶中加入1g对羟基苯甲醛，2g氯化锌，溶于20mL无水乙醇中；

(2)加入3mL N，N-二甲基苯胺，90℃回流24h，反应完毕，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，1/2，v/v)；

(3)将其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g(与底物摩尔比为1∶1.2)。在80℃下反应20h，反应完毕，减压去溶剂。加入稀盐酸调pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，无水硫酸镁干燥，减压去溶剂，柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)。

本发明提供的孔雀石绿抗原，是将式(1)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

所述孔雀石绿抗原的结构示意图见图3。

本发明还保护所述孔雀石绿抗原的制备方法，包括如下步骤：

(1)取10mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；

(2)取15mg二氯乙烷(EDC)用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；

(3)称取载体蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h；

(4)用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

(5)分装，于-20℃保存备用。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)，甲状腺蛋白(TG)和血蓝蛋白(KLH)等。

所述孔雀石绿抗原可以作为免疫抗原制备孔雀石绿特异性单克隆抗体，也可以作为包被抗原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。