[发明专利]一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种实时荧光定量RT-PCR检测人糖基转移酶，Lc3合成酶β3Gn-T5的试剂盒，是一种通过逆转录（RT）mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，精确定量检测标本中Lc3合成酶β3Gn-T5的mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

肿瘤（Tumor）是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。一般认为，肿瘤细胞是单克隆性的，即一个肿瘤中的所有瘤细胞均是一个突变的细胞的后代。一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。所有的恶性肿瘤总称为癌症（cancer）。

目前肿瘤的发生率与死亡率居高不下，并且有愈演愈烈的趋势，已经成为威胁我国及世界人民健康的一大类疾病。对于肿瘤的治疗一直是大家研究的热点，但是就目前的情况来看，恶性肿瘤的治愈还有很大的难度，然而如果能对肿瘤患者进行早期的诊断，对进一步制定治疗方案有非常重要的意义，是提高肿瘤治愈率的重要途径之一。而肿瘤的早期诊断有赖于肿瘤特异性标记的发现，肿瘤特异性标记是目前肿瘤领域的研究热点之一，肿瘤相关的蛋白有80%是糖蛋白，多种糖脂亦与肿瘤密切相关，所以控制糖脂的糖基转移酶也受到关注。

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速，其特点是由造血干细胞恶变而形成的原始细胞克隆取代了正常骨髓造血。由于白血病细胞代替了正常血细胞，它们不具备正常血细胞的功能，由此导致贫血，血小板和粒细胞减少而引发一系列并发症。若不经过治疗，存活期一般不超过半年。有的病例从诊断到死亡，甚至不过一周，死亡的主要原因是出血和感染。

目前标准化疗可以获得约70～80%的完全缓解（Complete Remission，CR）率，但大部分CR后的患者终将复发，甚至一部分患者难以达到CR而成为难治性白血病，治疗无效而死亡。

分子生物学从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质，近年来，随着分子生物学的迅速发展及其在医学领域的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在临床组织样本中进行肿瘤特异性标记的检测已成为可能并被尝试。RT-PCR比传统的检测方法具有较高的灵敏度及特异性，能够在复杂的生物样本中检测到极其微量的肿瘤特异性标记物，对于肿瘤的早期诊断以及长期的预后具有十分重要的价值。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，提高检测的特异性、灵敏度和准确率。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种诊断急性髓细胞白血病的试剂盒，包括：逆转录体系和PCR扩增体系；所述逆转录体系包括：T重复寡核苷酸Ologo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述PCR扩增体系包括：SYBR Green聚合酶链反应体系、引物对；

其中，所述逆转录反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液；

所述SYBR Green聚合酶链反应体系含有PCR缓冲液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green荧光染料；所述模板cDNA包括：正常人骨髓样本cDNA和急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA，其中，正常人骨髓样本cDNA作为阴性对照，急性髓细胞白血病患者骨髓样本cDNA作为阳性对照；

所述引物对为可扩增人Lc3合成酶β3Gn-T5和人β-actin的引物对，本领域技术人员可以根据引物设计的常规技术设计；优选的技术方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中上游引物具有SEQ ID No.1所示序列：5′-ttttggattggtcgtgttcat-3′；下游引物具有SEQ ID No.2所示序列：5′-cggctgtgtagtcagggtaag-3′；人β-actin上游引物具有SEQ ID No.3所示序列：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3′；下游引物具有SEQ ID No.4所示序列：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。

上述技术方案中，所述焦炭酸二乙酯处理的水的制备方法为：将焦炭酸二乙酯原液与超纯水按照体积1∶1000稀释，搅拌12～24小时，取该混合均匀的溶液进行高压湿热灭菌即制得焦炭酸二乙酯处理的水。