[发明专利]甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

权利要求书

1.一种甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.权利要求1所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3.权利要求1所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，包括以下步骤：

（1）从甘蔗条螟预蛹期幼虫提取总RNA，然后反转录合成cDNA；

（2）根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物：

CsHR3-middle fragment-P1：5'-ACAGWGGTGAACTACCAGTG -3' 

CsHR3-middle fragment-P2：5'-GACCATGRAATTGGTCGCT-3'

（3）以cDNA为模板，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段；

（4）纯化步骤（3）所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T simple 载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选含CsHR3中间片段的阳性克隆子；

（5）根据CsHR3中间片段的测序结果，设计3’RACE特异性引物，以甘蔗条螟cDNA为模板，PCR扩增CsHR3基因的3’片段序列；

CsHR3-3' RACE-GSP1：5' - CGGGTCAACAGGAATAGATGTCA -3'

CsHR3-3' RACE-GSP2：5'- CAGCGCCTGACTCAGTGTATGAC-3'

（6）纯化步骤（5）所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选获得CsHR3基因3’端的阳性克隆子；

（7）将步骤（4）和（6）所得的阳性克隆子进行序列测定，然后将测定所得序列通过生物信息学软件DNAman拼接，得到CsHR3基因1266 bp序列。

4.如权利要求3所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，所述步骤（1）中反转录合成cDNA具体为：取总RNA 5微升、Random引物1微升、底物dNTPs 2微升，用RNase-free H₂O加至10微升，混匀，65℃保温5min，迅速放至冰上冷却3min；然后在上述混合物中加入5×Primer Script Buffer 4微升、RNA酶抑制剂0.5微升、AMV反转录酶0.5微升，并用RNase-free H₂O加至20微升，42℃反应60min，70℃灭火15min，4℃冷却，-20℃保存备用。

5.如权利要求3所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，其特征在于，步骤（3）和（5）中PCR扩增所用的反应试剂组成及反应条件如下：首先将下述试剂混合在一起，

模板cDNA                1μl

脱氧核苷酸底物dNTP      4μl

Ex-Taq DNA聚合酶        0.5μl

10×Taq DNA 聚合酶缓冲液  5μl

正向引物（10μM）         2μl

反向引物（10μM）         2μl

ddH₂O                   35.5μl

总体积                   50μl

反应条件为：首先94℃预变性3分钟；然后进行如下循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共进行32循环；最后72℃延伸10分钟。

6.权利要求1所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，采用细菌介导RNAi技术在RNaseIII缺陷型大肠杆菌HT115中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治；或者通过基因工程方法将甘蔗条螟蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。

7.一种细菌介导RNAi防治甘蔗条螟的方法，其特征在于，选择甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因作为靶标，选定其CsHR3基因上含有非LBD功能结构域和LBD功能结构域的两个dsRNA干扰片段，构建细菌介导的RNAi重组载体L4440-CsHR3-I1、L4440-CsHR3-I2，同时选用绿色荧光蛋白基因EGFP作为阴性对照，清水作为负对照；通过热激法将上述载体导入Ecoli. HT115（RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌）中，加入0.8mM IPTG进行诱导表达，提取细菌表达dsRNA进行甘蔗条螟幼虫的饲喂试验，记录3龄和5龄甘蔗条螟饲喂7天后表型变化及体内CsHR3基因mRNA降低水平。