[发明专利]甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域中的克隆、表达技术，具体涉及甘蔗条螟生长发育关键基因——蜕皮调节转录因子CsHR3基因克隆及细菌介导RNAi技术表达CsHR3 dsRNA，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程。

背景技术

随着世界人口的急剧增长，如何提高农作物产量是一个迫在眉睫的问题。据统计，因虫害引起的粮食损失占整个粮食收成的20%。因此，如何有效控制虫害是提高作物产量的一个重要因素。大量使用化学农药虽然可以抑制虫害，但容易引起昆虫的抗性，而且对环境破坏极大，不利于人类的可持续发展。随着生物技术的快速发展，通过转基因方法改造植物，提高植物自身的抗虫害能力已成为农作物育种的主流。上世纪九十年代，科学家们利用转基因手段使农作物表达Bt蛋白以提高农作物对农业害虫的生物防治在全球被广泛使用。然而，最近的研究发现：有些昆虫的中肠上皮细胞中丢失了一类能与Bt蛋白结合的受体而使昆虫对Bt蛋白产生了抗性。最近，在农业上RNAi技术已发展成为一种控制虫害、提高作物品质的新方法。

RNA干扰（RNAi）是一种新发现的基因调控机制。人们从植物的基因表达共抑制和真菌的抑菌作用现象发现了RNA干扰这一古老的生物体基因调控机制。早在1998年，Fire等人发现双链RNA（dsRNA）可导致靶基因的表达抑制。不久，RNA干扰已发展成为一种成熟技术，被广泛应用于靶基因的功能研究中。 在昆虫中，通过dsRNA诱导的RNA干扰（RNAi）可用来研究昆虫基因的功能。尤其是近年来，细菌介导或植物介导RNAi表达dsRNA的方法已在多种昆虫中诱导靶标基因的沉默。然而，还有很多科学问题需要去探讨和研究，如通过RNAi介导沉默害虫非中肠基因能否诱导害虫死亡表型的出现；RNAi介导表达dsRNA量与害虫死亡表型或生长发育阻碍是否呈正相关；RNAi介导沉默靶标基因的周期与害虫生测表型之间的相关性；选择哪一靶标基因在害虫生物防治中周期短、生测效果好、更加高效等，这一系列问题都需要在试验探索和研究中验证。

RNAi技术在昆虫中研究功能基因的方法主要是注射法，一般通过把预干扰靶标基因dsRNA或siRNA用微量注射器导入昆虫的胚胎或体腔，从而实现对靶标基因mRNA表达的抑制。注射法RNAi虽然在昆虫功能基因方面取得了巨大的成绩，但也存在以下诸多问题：首先，注射法RNAi对实验操作人员技术要求很高、难度大、强度大，极易因操作不当而导致数据不准及昆虫死亡。其次，注射法RNAi制备dsRNA或siRNA均需要借助昂贵的国外试剂盒完成，增加了实验成本，所制备dsRNA或siRNA的量却很少。最后，注射法RNAi往往需要对单一昆虫逐个进行注射操作，为其广泛应用田间害虫生物防治增加了难度。为了能满足方便地研究昆虫功能基因需要，特别是为探索新的害虫生物防治方法，需要更好的细菌介导或植物介导RNAi技术在昆虫功能基因研究应用。

蜕皮调节转录因子是一类同时启动蜕皮早期基因簇表达，又抑制蜕皮晚期基因簇表达的调节因子，在昆虫蜕皮过程中发挥重要的基因表达调控作用。现有研究发现，可从多种昆虫中获得HR3家族的生长发育关键基因，如棉铃虫HaHR3、烟草天蛾MHR3、果蝇DHR3等。Josefa等从德国小蠊中克隆到蜕皮调节转录因子BgHR3，并通过RNAi技术抑制BgHR3基因表达，结果发现幼虫不能脱掉旧表皮，发生皮层溶离，表明BgHR3基因直接参与德国小蠊幼虫蜕皮。昆虫若不能正常蜕皮，则无法变成成虫，从而形成取食量降低、没有生命力甚至死亡表型的个体。蜕皮调节转录因子是蜕皮过程中关键因子，同时也受到机体相关基因的严格调控，当表达水平降低或异常提高时都会影响昆虫的正常蜕皮。因此，打破蜕皮基因的平衡，干扰昆虫蜕皮，破坏其正常的生长发育过程，可达到杀灭害虫和控制害虫种群的目的。

国外已对果蝇、烟草天蛾、德国小蠊等蜕皮调节转录因子进行了基因克隆和作用机理研究。其中果蝇的DHR3研究较为深入，该基因在果蝇蜕皮和变态生长发育中起关键作用。GenBank数据库中目前尚无关于甘蔗条螟蜕皮调节因子基因的记录和研究报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种从甘蔗条螟幼虫中提取的甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA，并提供甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法以及重组应用，还提供了一种细菌介导RNAi技术防治甘蔗条螟的新方法。