[发明专利]一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法。

背景技术

大豆[Glycine max Merill]是世界上重要的油料和蛋白来源之一，建立有效的转化体系有助于提高大豆产量、提高病虫害抗性以及改善蛋白和油料的品质，并能弥补传统育种的不足和缺陷。另外，大豆功能基因组学研究的快速发展，增强了程序化和有效转化系统的需求。然而，大豆是公认的较难转化的作物之一，同时，由于缺乏有效的和可重复的基因转化体系，致使大豆的遗传改变十分困难(参考文献：J.C.Popelka，N.Terryn，T.J.V.Higgins，Gene technology for grain legumes：can it contribute to the food chal lenge in developing countries，Plant Sci 167(2004)195-206.)。对于大豆遗传转化而言，花粉管通道法和农杆菌介导的子叶节法是最为常用的方法。自从1988年，Hinchee等应用农杆菌介导的子叶节法获得第一株转基因植株，农杆菌介导的子叶节法被应用于了大豆的遗传转化研究中。随后，人们通过各种努力改进这种体系，虽然应用这种传统的单个子叶节的方法得到了一些转化植株，但是这种方法的转化周期长达7周以上(参考文献：Z.Zhang，A.Xing，P.Staswick，T.E.Clemente.The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean.Plant Cell Tissue Organ Cult 56(1999)37-46.；P.M.Olhoft，K.Lin，J.Galbraith，N.C.Nielsen，D.A.Somers The role of thiol compounds inincreasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-nodecells，Plant Cell Rep 20(2001)731-737；PM Olhoft，LE Flagel，CM Donovan，et al.Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method.Planta，2003，216：723-735)，严重影响着基因工程技术在大豆遗传改良中的应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法，包含外植体的获得，遗传转化及共培养，芽伸长及筛选培养，生根培养；其特征在于：以整体子叶节作为外植体，用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液侵染整体子叶节进行遗传转化。

所述的整体子叶节外植体通过如下方法获得：取饱满、无病虫害的大豆种子，消毒后将种子在无菌水中浸泡12小时后接种于MSB培养基，培养6-7天当无菌苗的两子叶刚展开，去掉初生叶、上胚轴、根，留取约3-3.5cm的完整的子叶下轴和两个子叶，在两子叶之间的腑芽和顶端分生组织表面用无菌刀片轻轻的划5-6下，就得到用于转化的整体子叶节外植体。

所述的遗传转化及共培养是用无菌棉球蘸取携带目标基因的农杆菌工程菌液放于两子叶间的划伤组织上，接种在附加3.5mg/L BAP、0.2mg/LIBA、0.2mg/LKT，pH5.8的MSB培养基中，于26℃、黑暗条件下与携带目标基因的农杆菌菌液棉球共培养3天。

所述的共培养的第二天用移液枪吸取携带目标基因的农杆菌工程菌液滴到所述的无菌棉球上，所用菌液中附加500mg/L的L-半胱氨酸。

所述的共培养结束后，去掉棉球，不转换培养基，直接将外植体转入光下，于26℃培养，7天后，外植体转入附加500mg/L头孢噻肟和150mg/L卡那霉素，pH5.8的MSB进行为期12天的芽的伸长及筛选培养，当抗性分化芽长至3-4cm时，切下，转入生根培养基：附加1.0mg/LNAA、500mg/L头孢噻肟，pH5.8的MSB中进行生根10-15天，10-15天后，生根的转基因植株可移栽入土中。

有益效果：