[发明专利]一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，属于细胞工程和组织工程领域。

背景技术

从脂肪组织中分离培养的细胞多称为“前体脂肪细胞”。前体脂肪细胞是一类具有增殖分化能力的脂肪细胞前体，在体内多种因素的影响下聚脂分化而成为成熟脂肪细胞。目前报道培养成功的前体脂肪细胞主要来源于人、鼠、猪等。Aso等在1995年于牛肌细胞间SV(stromal vascular)细胞培养物中分离克隆出前体脂肪细胞系。近年来，国内一些实验室也陆续对牛脂肪细胞展开了研究。目前所用的培养方法主要有组织块培养法和传统消化培养法。采用组织块培养法时，需先将脂肪组织用眼科剪刀剪至每块约1mm³大小，然后用玻璃细管接种到培养瓶内，3-4天后有少量细胞游离出来贴壁生长，约10-12天后有80-90％细胞贴壁，因此，此培养方法所需时间较长、人力较多。而采用传统消化培养法时，也需先将脂肪组织用眼科剪刀剪至每块约1mm³大小，然后加入胶原酶I在37℃培养箱内消化30分钟，之后离心洗涤，最后接种到培养瓶内。培养1天后有少量细胞开始贴壁生长，7-8天后约有80-90％细胞贴壁，因此，该方法较组织块培养法省时间，但在剪碎组织时同样很费人力。

发明内容

为了克服上述两种培养方法存在的技术缺陷，本发明旨在提供一种简单高效、节省时间和人力、可重复性强的牛前体脂肪细胞体外培养方法。本发明基于传统消化培养方法，利用组织匀浆机结合胶原酶I培养基处理脂肪组织，采用含胎牛血清的DMEM/F12培养液对牛前体脂肪细胞进行体外培养，成功建立了牛前体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。通过体外培养牛前体脂肪细胞，可深入了解脂肪细胞的增殖分化规律，为后续深入研究前体脂肪细胞增殖分化过程中基因、蛋白的表达及信号通路奠定基础。且为调控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病(酮病、脂肪肝)等提供新思路和新方法。

本发明的技术方案是：一种对牛前体脂肪细胞进行体外培养的方法，其特征是，利用牛皮下脂肪细胞在体外通过改良消化法进行培养，继而获得牛前体脂肪细胞；具体如下：

(1)试剂

0.1％胶原酶I培养基：将100mg胶原酶I溶解于100毫升D-Hanks液中，用5.6％NaHCO₃溶液调节PH值至7.2～7.4，经0.22微米过滤器过滤、分装，-20℃保存备用。

细胞培养液：在DMEM/F12液中添加其体积10％的胎牛血清，经0.22微米过滤器过滤、分装，4℃保存备用。

(2)牛前体脂肪细胞的原代培养

a无菌条件下取牛皮下脂肪组织，将其移入预先盛有D-Hanks液的平皿，漂洗5～8次，用眼科剪去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织；

b然后剪切组织块至8～10mm³小块，用组织匀浆机180～200r/min匀浆至乳糜状；继而加入0.1％胶原酶I培养基消化30min，其间每5min振荡1次；

c经200目不锈钢细胞筛过滤去除未消化组织块及大体积的脂肪细胞，将细胞悬液移入离心管，2000r/min离心5min；弃去离心后的上清液，加入细胞培养液清洗1次，2000r/min离心10min，制成细胞悬液，显微镜下计数，以5×10⁴cells/mL接种细胞至培养皿或培养瓶，置入37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。

本发明工艺先进简单、培养基配制科学合理。采用0.1％胶原酶I和含胎牛血清的DMEM/F12液对牛皮下脂肪细胞在体外通过改良消化法进行培养，继而获得牛前体脂肪细胞。

本发明通过体外改良消化法培养牛前体脂肪细胞，成功建立了牛前体脂肪细胞体外培养的新模型，极大的缩短了试验样品处理的时间，且获得细胞形态最好，培养及提取RNA效率最高，是一种更为便捷、长期高效的前体脂肪细胞培养方法。为后续深入研究前体脂肪细胞增殖分化过程中基因、蛋白的表达及信号通路奠定基础，为调控肉牛体脂沉积、预防奶牛围产期和泌乳高峰期疾病(酮病、脂肪肝)等提供新思路和新方法。

附图说明