[发明专利]无寡肽的细胞培养基

说明书

本申请是申请日为2007年1月3日、申请号为200780001787.1(PCT/EP2007/000027)、发明名称为“无寡肽的细胞培养基”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及无寡肽的细胞培养基，其包含至少0.5mg/L的多胺；本发明还涉及在所述包含至少0.5mg/L的多胺的无寡肽细胞培养基中培养细胞的方法。本发明还涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培养基中表达至少一种蛋白质的方法，并且涉及在包含至少0.5mg/L的多胺的培养基中制造至少一种病毒的方法。

背景技术

为了培养细胞、特别是真核细胞、更具体地说哺乳动物细胞，存在一种固有观念，就是必须使用配有所需营养物质的专门培养基，这些营养物质用于细胞的有效生长并用于生产生物制品，尤其是生物药物，例如诸如重组体蛋白、抗体、病毒、病毒抗原以及病毒状颗粒。为了有效地生产所述生物制品，重要的是达到最佳细胞密度以及本身提高的蛋白质表达，以便获得最大的产率。

细胞培养基配方已经补充有许多添加剂，包括不明确的组分，像胎牛血清(FCS)、数种动物衍生蛋白和/或牛源蛋白质水解物、以及来源于植物或者酵母的蛋白质水解物。

通常，血清或者血清衍生物质比如诸如白蛋白、转铁蛋白或者胰岛素，可能包含不希望有的、可以污染细胞培养基的试剂和由此得到的生物制品。另外，需要对人血清衍生添加剂进行所有已知病毒的测试，包括可以经血清传播的肝炎病毒和艾滋病病毒HIV。而且，牛血清和其衍生产物承担着牛海绵样脑病BSE污染的风险。此外，所有的血清衍生产物可能会被未知的物质污染。当在细胞培养基中使用来源于人或动物的血清或者蛋白质添加剂时，特别是如果该细胞被用于制造给药于人的药物或疫苗时，存在许多的问题(例如，不同批次的组合物品质发生变化，并且存在支原体、病毒或牛海绵样脑病BSE的污染风险)。

所以，人们进行了许多尝试，以提供有效的宿主体系和培养条件，其不需要血清或者其他的动物性蛋白质化合物。

基于来源于植物或酵母的蛋白提取物，已开发了这样的无血清培养基。例如，人们熟知的用于发酵工艺并且可以增强许多在合成培养基上不易生长的微生物、酵母和真菌的生长的大豆水解物。专利WO 96/26266描述到，大豆粉的木瓜蛋白酶消化液是碳水化合物的提供源和氮源，并且许多组分可以用于组织培养。Franek等(生物技术进展(2000)16，688-692)描述了限定的大豆和小麦水解物肽组分的生长和生产率促进效果。

WO 96/15231公开了一种无血清培养基，由合成的最低必需培养基和酵母提取物组成，用于脊椎动物细胞的增殖和病毒的生产工艺。在WO 98/15614中公开了一种培养基配方，其由包含大米肽和酵母提取物及其酶消化液的基础细胞培养基和/或植物脂类组成，用于动物细胞的生长。WO 01/23527公开了一种培养基，其包含精制的大豆水解物，用于重组细胞的培养。WO 00/03000公开了一种培养基，其包含大豆水解物和酵母提取物，但还需要重组体形式的动物性蛋白质比如生长因子的存在。

欧洲]专利EP-A-0 481 791描述了一种生物化学限定的用于培养工程菌CHO细胞的培养基，其不含由动物源分离的蛋白质、脂类和碳水化合物，其还包括重组胰岛素或者胰岛素类似物、1％～0.025％w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。专利公开WO 98/08934描述了一种无血清真核细胞培养基，其包含：水解大豆肽(1～1000mg/L)，0.01～1mg/L的腐胺，和多种动物衍生组分包括白蛋白、胎球蛋白、各种激素及其他蛋白质。在上下文中，应当注意，已知标准培养基像DMEM/Ham′s F12中包含0.08mg/L浓度的腐胺。

然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其他未知组分及杂质的不明确的混合物。另外，市场上可买到的许多水解物的品质变化极大。其结果是，在重组体蛋白或者病毒产品的生产中有很大的变化(高达3倍的变化)，这与使用的许多水解物(“批间偏差”)有关。这种不利因素影响到细胞的增殖以及各细胞的蛋白表达。

总之，现有技术中已知的培养基补充了来源于动物、植物或酵母的蛋白质或多肽提取物；补充了重组形式的蛋白质，例如诸如胰岛素、类胰岛素生长因子或者其他生长因子。

所以，为克服上述问题，人们很需要一种不含动物、植物和真菌蛋白和/或寡肽的细胞培养基。另外，目前还有一种需要，是提高表达的重组体蛋白产量或者任何其他的表达产品的产量，并且提供一种最佳的细胞培养基，用于生产生物制品比如人用药物或者疫苗。

发明内容