[发明专利]烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）分别设计合成SPCSV 病毒的3条引物：

CSV70P1: 5′-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3′，

CSV70P2: 5′-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3′，

CSV70P3: 5′-TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3′，

其中K为 G 或 T，R为 A 或 G，Y为C或 T，H为A、T或C；

（2）用解剖针挑取烟粉虱，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（3）以反转录产物作为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3进行半巢式RT-PCR的第二轮扩增，预期扩增片段大小为170bp；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述反转录的反应体系为10μl，包括：4 μL RNA 模板，2μl 5×RT buffer，0.5μL浓度为10 μmol/L的CSV70P2，1 μL浓度为10 mmol/L 的dNTPs，0.25 μL浓度为40U/μl的RNase抑制剂和0.5 μL浓度为5U/μl的AMV反转录酶，余量为DEPC-H₂O。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反转录的反应程序为：42℃反转录40min，99℃反应5min，5℃反应5min，反应后得到反转录产物。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应体系为25μl，包括：2.5μL10×PCR buffer，1μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L 的CSV70P1和CSV70P2各0.5 μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2.5μl反转录产物作模板，余量为ddH₂O。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二轮扩增是将第一轮RT-PCR的扩增产物稀释20倍，取1μL稀释产物作为第二轮PCR扩增的模板，第二轮PCR扩增反应体系为25μl，包括：2.5 μL10×PCR buffer，1μL浓度为2.5 mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L的CSV70P1和CSV70P3各0.5 μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，用ddH₂O补足至25 μL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二轮扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，完成32个循环，最后72℃延伸10min。

8.权利要求7所述的方法在检测单头或多头烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的应用。