[发明专利]烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用

说明书

  

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域中的病毒检测方法，特别是涉及一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的半巢式RT-PCR检测方法。 

背景技术

甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV)属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)成员。该病毒的基因组为双组份单链正义RNA，基因组大小为17.6 kbp左右。根据血清学关系和核苷酸序列，SPCSV可划分为东非（EA）和西非（WA）两个株系。上世纪70年代首先在非洲发现了SPCSV，目前主要分布在非洲和南美一些国家。我国自2010年首次发现SPCSV以来，目前在全国多个甘薯种植区陆续检测到该病毒病的存在。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特别重要的是，SPCSV可与马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD（sweet potato virus disease，SPVD）。SPVD是甘薯上是最严重的病毒病害之一，通常可使甘薯减产50%-98%，甚至绝收。 

SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由烟粉虱(Bemisa babaci)以半持久方式传播，感染SPCSV的甘薯通常会迅速形成SPVD，SPVD的流行跟烟粉虱的数量密切相关。SPCSV的长距离传播主要通过种薯和种苗，短距离主要通过烟粉虱进行传播。烟粉虱生存能力强、繁殖速度快。据报道，烟粉虱经过48h的饲毒就能进行有效传染，而且烟粉虱的数量越大，病毒传播的有效性越强。由于对SPCSV尚无特别有效的防治方法，做好烟粉虱带毒率的检测，加强对烟粉虱的防治，可有效减少SPCSV的蔓延扩散，减少病害引起的损失。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测烟粉虱中SPCSV的方法，对于该病的预警和防治具有重要意义。 

发明内容

    本发明要解决的技术问题：提供一种简便、快速、灵敏的半巢式 RT-PCR检测烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的方法。 

本发明的技术方案：

一种烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的检测方法，包括以下步骤：

（1）分别设计合成SPCSV 病毒的3条引物：

CSV70P1: 5′-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3′，

CSV70P2: 5′-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3′，

CSV70P3: 5′-TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3′，

其中K为 G 或 T，R为 A 或 G，Y为C或 T，H为A、T或C；

（2）用解剖针挑取烟粉虱，放入加有预冷RNA提取液的离心管中，提取烟粉虱的总RNA作为PCR模板，进行反转录；

（3）以反转录产物作为模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2进行半巢式RT-PCR的第一轮扩增，预期扩增片段大小为431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3进行半巢式RT-PCR的第二轮扩增，预期扩增片段大小为170bp；

（4）用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

所述反转录的反应体系为10μl，包括：4 μL RNA 模板，2μl 5×RT buffer，0.5μL浓度为10 μmol/L的CSV70P2，1 μL浓度为10 mmol/L 的dNTPs，0.25 μL浓度为40U/μl的RNase抑制剂和0.5 μL浓度为5U/μl的AMV反转录酶，余量为DEPC-H₂O。反应程序为：42℃反转录40min，99℃ 5min，5℃ 5min，反应后得到反转录产物。 

所述半巢式RT-PCR的第一轮扩增的反应体系为25μl，包括：2.5μL10×PCR buffer，1μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，浓度为10 μmol/L 的CSV70P1和CSV70P2各0.5 μL，0.2μL浓度为5U/μL的Taq酶，2.5μl反转录产物作模板，余量为ddH₂O；扩增的反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，完成35个循环，最后72℃延伸10min。