[发明专利]一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证

权利要求书

1.一种用于护唇类化妆产品中沙门菌的检查方法与验证，其特征在于：所述的检测步骤如下：

1.1菌液制备方法  按《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查试验菌液的制备方法，取经30～35℃培养18～24小时的沙门菌营养肉汤新鲜培养物1ml，加入9ml质量体积百分比0.9％的无菌氯化钠溶液中，10倍稀释制成10～100cfu的菌悬液备用；

1.2试验组

1.2.1前增菌和增菌  取供试品10g，加入无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混匀溶解，再加入试验用沙门氏菌悬液10～100cfu 1ml于36±1℃18～24小时培养，取10ml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42℃培养18～24小时；另取10ml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36±1℃培养18～24小时；

1.2.2分离  取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36±1℃分别培养40～48小时(BS)和18～24小时(HE)，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色；

1.2.3初步鉴定试验  从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上各挑取2～3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18～24小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产H₂S气；

1.2.4镜检  挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂培养基平板上，于36±1℃ 18～24小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌；

1.2.5生化试验

(1)靛基质试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基4ml/管中，于36±1℃培养1～2天，必要时可延长至4～5天，加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；

(2)尿素酶试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36±1℃培养24小时，观察结果，培养基未产碱变色；

(3)氰化钾及对照试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36±1℃培养24小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口；于36±1℃培养1～2天，观察结果，实验管澄清，对照管浑浊；

(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，4ml/管，培养18～24小时，观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；

以上生化实验结果为：靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致；

1.2.6血清凝集试验  取1滴A～F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混匀，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混匀作对照试验，结果对照无凝集现象，为血清凝集阴性反应；

1.3阳性组

1.3.1前增菌和增菌试验  取无菌聚山梨酯-80和无菌液体石蜡各10ml，研磨至粘稠状后加入70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中混匀，再加入试验用沙门菌液10～100cfu 1ml于36±1℃  18～24小时培养，取10ml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42℃培养18～24小时；另取10ml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36±1℃培养18～24小时；

1.3.2分离  取上述两种增菌培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上，36±1℃分别培养40～48小时(BS)和18～24小时(HE)，观察各平板上生长的菌落，结果Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板上生长的菌落中心为黑色，亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上生长的菌落为黑色且有金属光泽，菌落周围培养基为棕色或黑色；

1.3.3初步鉴定试验  从Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上各挑取2～3个菌落至三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养18～24小时，观察结果，Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)和亚硫酸铋琼脂培养基(BS)平板上的培养物在三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上底层均为黑色，斜面和底层为黄色均产H₂S气；

1.3.4镜检  挑取三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上生长的疑似单个菌落接种至营养琼脂平板上于36±1℃  18～24小时培养，做革兰染色镜检，观察，结果为革兰染色阴性无芽孢短杆菌；

1.3.5生化试验

(1)靛基质试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于蛋白胨水培养基4ml/管中，于36±1℃培养1～2天，必要时可延长至4～5天，加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇，观察结果，试剂层呈无色；

(2)尿素酶试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种于尿素琼脂斜面培养基上，于36±1℃培养24小时，观察结果，培养基未产碱变色；

(3)氰化钾及对照试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种至营养肉汤培养基管中，于36±1℃培养24小时，再用接种环挑取一环接种于氰化钾及不含氰化钾基础培养基(对照管)各1管，塞紧管口；于36±1℃培养1～2天，观察结果，实验管澄清，对照管浑浊；

(4)赖氨酸脱羧酶及对照试验  挑取少量TSI三糖铁琼脂斜面上的培养物，接种赖氨酸脱羧酶及不含赖氨酸的基础培养基(对照管)各1管，4ml/管，培养18～24小时，观察结果，实验管培养基呈紫色，对照管培养基呈黄色；

以上生化实验结果为：靛基质试验呈阴性，尿素酶试验呈阴性，氰化钾试验实验管阴性、对照管阳性，赖氨酸脱羧酶试验实验管阳性、对照管阴性，以上试验均符合典型的沙门菌属的生化反应且特征一致；

1.3.6血清凝集试验  取1滴A～F多价血清滴于载玻片上，从上述三糖铁(TSI)琼脂斜面培养基上穿刺划线培养的新鲜培养物中挑取少许菌落与血清涂抹混匀，常温下放置3分钟后观察结果均产生凝集，呈阳性反应，同时对出现凝集的待检菌落培养物用无菌生理盐水替代血清与培养物混匀作对照试验，结果对照无凝集现象，为血清凝集阴性反应；

1.4阴性组

1.4.1前增菌和增菌  分别取无菌聚山黎脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研匀加至70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中于36±1℃ 18～24小时培养，取10ml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42℃培养18～24小时；另取10ml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36±1℃培养18～24小时；

1.4.2分离  取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36±1℃分别培养40～48小时(BS)和18～24小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应；

1.5样品组

1.5.1前增菌和增菌  取供试品10g，再分别取无菌聚山梨脂-80和无菌液体石蜡各10ml，研匀加至70ml胰酪胨大豆肉汤培养基中于36±1℃18～24小时培养；取10ml培养物加四硫磺酸钠煌绿增菌培养基(TTB)至100ml，42℃培养18～24小时；另取10ml培养物加氯化镁-孔雀绿沙氏增菌培养基(RVS)至100ml，36±1℃培养18～24小时；

1.5.2分离  取上述培养物各1环，接种于1个亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和1个Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板，于36±1℃分别培养40～48小时(BS)和18～24小时(HE)，观察，亚硫酸铋琼脂培养基(BS)和Hektoen-肠道琼脂培养基(HE)平板均未有菌落生长，结果为阴性反应。