[发明专利]一种快速构建复层细胞的方法

说明书

技术领域：

本发明属于组织工程领域，具体的说是涉及一种快速构建复层细胞的方法。

背景技术：

组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，用以对病变或受损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。对于多细胞结构的复杂组织器官来说，细胞结构基础决定着组织器官的功能，如何制备具有生命力的复层细胞结构，对于本领域的发展和临床的实际应用具有重要的作用。

常规的复层细胞构建方法为：种植细胞逐层生长法，首先种植单层细胞，底层细胞可借助静电吸附或与细胞外基质的配体结合来粘附，经历足够时间后，单层细胞间可实现细胞融合，并进一步形成一定强度的细胞连接，继续给以一定的促生长或促分化培养条件，使其再逐层增殖或分化为复层细胞。其基本特点可概括为：形成单层细胞→单层细胞间连接形成→形成复层细胞。这种最为常规的培养细胞复层的方法被广泛应用于心肌、气管、皮肤和角膜组织的复层细胞构建研究中，虽然可最终形成与天然类似的大体组织学结构，但却存在如下明显的限制性因素：①构建复层细胞组织所需时间不具备临床应用的可行性：单层细胞增殖到融合，细胞与细胞之间受体特性体连接的形成，单层细胞的2维生长向复层细胞3维生长的转变，均需较多的构建时间(数周)。对于需要组织工程产品替代的急性组织缺损来说，数周的体外构建时间，已经远远超出了临床诊治时所能提供的治疗时限。②生物学和物理学功能不完善：目前的体外生物反应器还无法完全模拟体内条件下细胞生长所面对的真正微环境，其提供的营养和氧气供应方式以及代谢废物的去除方式，与体内条件差异仍然很大。因此，较长的构建时间通常会导致构建的细胞复层出现细胞过度分化和老化，各种细胞的黏附和增殖功能也会不断下降，同时细胞复层的各种物理学功能(细胞层的生物力学强度、电生理功能、组织极性等)也会相应下降。这些构建组织的各种功能学不足也严重制约了最终的临床应用。

发明内容：

本发明的目的是提供一种构建时间短，构建的复层细胞具备更好的生物力学强度和更好的细胞生物学功能的快速构建复层细胞的方法。

本发明的快速构建复层细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将种子细胞和液态的细胞外基质凝胶混悬得到液体混悬液；

b)将液态混悬液置于构建载体上，使载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，直接形成复层细胞结构，然后加入培养液培养复层细胞至足够强度。

所述的种子细胞指的是所需构建复层细胞组织的细胞，这些细胞可以经过体外培养扩增或是从组织块中新鲜分离，如角膜上皮细胞、表皮上皮细胞、成纤维上皮细胞或心肌细胞。

所述的细胞外基质凝胶是指所需构建组织的细胞(种子细胞)相对应的细胞外基质成分的混合物或者单一成分所形成的凝胶，如角膜上皮细胞(种子细胞)对应角膜基质凝胶，人表皮上皮细胞和成纤维细胞(种子细胞)对应人皮肤基质凝胶，心肌细胞(种子细胞)对应心脏基质凝胶。可以为所需构建组织的细胞外基质蛋白质、多糖和糖蛋白的混合物或单一成份所形成的凝胶。本领域技术人员可以根据所需构建组织的细胞，按照本领域的常规知识获取其该细胞外基质凝胶。如利用各种变性蛋白质提取方法或非变性蛋白质提取方法，从天然动物组织中提取并纯化出各种细胞外基质蛋白的单一成分或者混合成分制备凝胶溶液。优选利用非变性蛋白质提取方法，提取所构建组织的细胞外基质蛋白质、多糖和糖蛋白的混合物或单一成分来制备基质凝胶。这种凝胶的突出优点在于提供了种子细胞本身的基质微环境，可有效的结合种子细胞表面的各种整合素受体，避免种子细胞凋亡。同时这种基质凝胶可以吸附各种生长因子，达到生理状态的缓释效果。一般可通过控制细胞外基质凝胶的温度和浓度使其呈液态，优选温度为20～37℃。

所述的构建载体指的是利用天然组织脱细胞基质形成天然支架材料，或是利用合成材料构建的高分子支架材料，其主要起载体作用。利用合成材料构建的高分子支架材料可以从现有技术中购买，而利用天然组织脱细胞基质形成天然支架材料属于常规技术。所述的构建载体优选为利用脱细胞角膜基质、脱细胞皮肤基质或脱细胞心脏基质形成的天然支架材料。

所述的将载体上的液态混悬液凝固成固态凝胶，其方法包括降低温度或使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度或两者的结合来使液态混悬液凝固成固态凝胶。所述的降低温度是指降低液态混悬液的浓度从而使液态混悬液形成固态凝胶的温度，优选温度为4～20℃。所述的使液态混悬液脱水以提高凝胶浓度优选利用载体的吸水性实现液态混悬液的脱水从而提高凝胶浓度使液态混悬液形成固态凝胶或利用负压蒸发的方式脱水浓缩液态混悬液形成固态凝胶。