[发明专利]一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法

权利要求书

1.一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少三对参照引物组成：

所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性；

所述嵌合特异引物和所述参照引物针对检测区段和参照区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28～50bp，3’端为18～25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合引物之间的TM值的差异不超过3℃；所述三对参照引物设计在相同或不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；

所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；

(2)定量合成内对照DNA片段：针对每一个待测区段和每一个参照区段的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测区段和参照区段的扩增产物片段相比插入或缺失2～3bp的DNA片段；

(3)多重竞争性PCR的反应过程：

(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍mol数的内对照DNA片段混合在一起，然后进行PCR，前3～16个循环，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，后17～20个循环，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，两组退火温度的差距≥5℃；

(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；

(4)数据分析

i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I)；

ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；

iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；

iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用荧光引物长度范围为18～20bp。

3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为38～45bp。

4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为120～350bp，不同扩增产物片段的长度差异为8～50bp。

5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18～20bp。

6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和三到六对针对相同或不同基因的参照引物组成。

7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和三到五对参照引物组成。

8.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的三到六对参照引物中至少两对设计在常染色体上，至少一对设计在X染色体上。

9.权利要求1所述的分析方法在检测基因拷贝数变异中的应用。

10.一种基于权利要求1所述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNA、和/或多重竞争性PCR的反应的试剂。