[发明专利]一种多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。

背景技术

拷贝数变异(copy number variations，CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中1kb～3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。

随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo，Lampel et al.1997)、全基因组SNP芯片(Irving，Bloodworth et al.2005)、代表性寡核苷酸微阵列技术(Lucito，Healy et al.2003)等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)(Schouten，McElgunn et al.2002)和多重可扩增探针杂交(MAPH)(Armour，Sismani et al.2000)等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。

竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y＝A(1+R)ⁿ来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，n表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上(存在一些碱基的插入或缺失)存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板(待测样本和内对照不存在拷贝数差异)量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或削除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT法(Paralogue Ratio Test)(Armour，Palla et al.2007)是基于竞争性PCR的一种检测CVNs的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。内对照可以采用人工合成的方法，还有其他的一些制备方法(Zentilin and Giacca 2007)，不过这种方法设计的内对照序列较待测位点的序列不一致，导致两者PCR扩增效率差异大，最终影响拷贝数的检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、通量较高、样本需求低、检测灵敏性高的CNVs检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

技术方案之一是提供一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：

(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少三对参照引物组成：

所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性；

所述嵌合特异引物和所述参照引物针对参照区段和检测区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28～50bp，3’端为18～25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合引物之间的TM值的差异不超过3℃；所述三对参照引物设计在相同或不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；