[发明专利]青霉菌细胞内外蛋白质组的提取

权利要求书

1.青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是包括如下步骤：

(1)细胞内蛋白的提取：

在LB培养基中接种青霉菌，培养，从接种1～2h起至170～180h，选8～12个时间点，每个时间点收集1～3份细胞，每份细胞分别用冰浴的0.5～5mM苯甲基磺酰化氟-超纯水溶液洗涤3～5次；-10～4℃收集洗涤后的细胞，在液氮中研磨成细胞粉末；取0.1～1g所述细胞粉末悬浮于裂解缓冲液中，再加入10～15μl DNase I和RNaseA的水溶液，冰浴放置15～30min，加入10～15μl浓度为0.8～1.2mM苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液，超声10～15秒/次，共3～5次，以10,000～100,000xg的转速离心10～60min后，收集上清液，在-15～-30℃的条件下与1～10倍于上清液体积的冰浴的丙酮混合，放置2～10h；再以10,000～100,000xg的转速离心10～60min，将沉淀物冻干，得到细胞内蛋白组，测定蛋白含量；

所述裂解缓冲液的配制为：5～8mol尿素、1～3mol硫脲、10～50mg 3-((3-胆汁氨丙基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20～50mmol Tris碱，加水定容至1L；

所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制为：8～15mg DNaseI，2～4mg RNaseA、30～60mmol MgCl₂、0.1～1mol Tris-HCl，调pH为7.0，加水定容至1L；

(2)细胞外蛋白的提取：

在LB培养基中接种青霉菌，培养，在生长周期的OD₅₄₀值分别在1～10之间取3-5份1L的发酵液，在1～10℃，10,000～100,000xg离心10～60min，上清液通过0.1～1μm孔径过滤，滤液加入冰浴的三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10～20mg/100ml，进行沉淀，用体积浓度为80％-90％的丙酮水溶液洗涤沉淀4-5次，得到细胞外蛋白组，测定蛋白含量。

2.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述时间点为10个，每个时间点收集2～3份细胞。

3.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述苯甲基磺酰化氟-超纯水溶液的浓度为1～2mM。

4.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述步骤(1)或步骤(2)中转速为20,000xg，离心时间为40min。

5.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制中所述DNase I为10～12mg。

6.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制中所述RNaseA为2.5～3mg。

7.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液的浓度为1mM。

8.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述步骤(1)中上清液与冰浴的丙酮混合时的温度条件为-20℃。

9.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述步骤(2)中发酵液的份数为4份。

10.根据权利要求1所述的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是所述步骤(2)中所述孔径为0.45μm。