[发明专利]青霉菌细胞内外蛋白质组的提取

说明书

技术领域

本发明属于工业微生物领域，涉及一种青霉菌细胞发酵过程中细胞内和发酵培养基中蛋白质的提取。

背景技术

作为一个最大的全球销售类抗生素药物，用于工业发酵生产的青霉菌经过多次菌种改良，并且人们已经清楚描述了关于青霉素的生物合成途径。由于可以获得青霉菌的基因序列，使得现在在蛋白组学水平上研究青霉素G的生产成为可能。然而，除青霉素合成基因、代谢工程和微体蛋白组学分析外，很少有人研究该真菌细胞内和细胞外的蛋白组，尤其是在可能直接或间接参与青霉素生物合成的工业发酵条件下的情况。据报道自溶导致青霉素V的降解、培养基滤过性等问题，这些与在产黄青霉的工业菌株批量培养中细胞内解朊作用和β-1-3-glucanolytic酶活性的增加密切相关。产黄青霉工业菌株在碳源和氮源受限时，丝氨酸和天门冬氨酰蛋白酶、金属蛋白酶都与自溶密切相关。可见探究工业发酵条件下产黄青霉菌的胞内外蛋白是非常有必要的，能够帮助我们理解其自溶和青霉素的降解机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种方便有效的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取。

本发明的技术方案概述如下：

青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，包括如下步骤：

(1)细胞内蛋白的提取：

在LB培养基中接种青霉菌，培养，从接种1～2h起至170～180h，选8～12个时间点，每个时间点收集1～3份细胞，每份细胞分别用冰浴的0.5～5mM苯甲基磺酰化氟-超纯水溶液洗涤3～5次；-10～4℃收集洗涤后的细胞，在液氮中研磨成细胞粉末；取0.1～1g所述细胞粉末悬浮于裂解缓冲液中，再加入10～15μl DNase I和RNaseA的水溶液，冰浴放置15～30min，加入10～15μl浓度为0.8～1.2mM苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液，超声10～15秒/次，共3～5次，在10,000～100,000xg的转速下离心10～60min后，收集上清液，在-15～-30℃的条件下与1～10倍于上清液体积的冰浴的丙酮混合，放置2～10h；在10,000～100,000xg的转速下离心10～60min，将沉淀物冻干，得到细胞内蛋白组，用Bradford方法测定蛋白含量；

所述裂解缓冲液的配制为：5～8mol尿素、1～3mol硫脲、10～50mg 3-((3-胆汁氨丙基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20～50mmol Tris碱，加水定容至1L；

所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制为：8～15mg DNaseI，2～4mg RNaseA、30～60mmol MgCl₂、0.1～1mol Tris-HCl，调pH为7.0，加水定容至1L；

(2)细胞外蛋白的提取：

在LB培养基中接种青霉菌，培养，在生长周期的OD₅₄₀值分别在1～10之间取3-5份1L的发酵液，在1～10℃，10,000～100,000xg的转速下离心10～60min，上清液通过0.1～1μm孔径过滤，滤液加入冰浴三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10～20mg/100ml进行沉淀，用体积浓度为80％-90％的丙酮水溶液洗涤沉淀4-5次，得到细胞外蛋白组，用Bradford方法测定蛋白含量。

所述时间点为10个，每个时间点收集2～3份细胞。

所述苯甲基磺酰化氟-超纯水溶液的浓度为1～2mM。

所述步骤(1)或步骤(2)中转速为20,000xg，离心时间为40min。

所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制中所述DNase I为10～12mg。

所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制中所述RNaseA为2.5～3mg。

所述苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液的浓度为1mM。

所述步骤(1)中上清液与冰浴的丙酮混合时的温度条件为-20℃。

所述步骤(2)中发酵液的份数为4份。

所述步骤(2)中所述孔径为0.45μm。

本发明提供了一种有效的青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，利用本发明的方法可以方便有效的提取蛋白，为鉴定不同工业发酵条件下蛋白变化奠定了基础。