[发明专利]一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法

权利要求书

1.一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，其特征在于，包括有以下步骤：

1）绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；

2）将步骤1）得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8mm小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；

3）将步骤2）得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；

4）将步骤3）得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2-3次后，得到胚性愈伤组织；

5）将步骤4）得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。

2.根据权利要求1所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤1）中，

硫酸脱绒所用的为95%的浓硫酸；

消毒洗涤的过程为：绿棉种子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%过氧化氢浸泡3h，无菌水冲洗5-8遍，最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；

无菌绿棉种子的培养周期为4-8天，光暗交替过称为黑暗3-5天，关照1-3天。

3.根据权利要求1或2所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤2）中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了0.05-0.15mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.15mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.05-0.15mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。

4.根据权利要求3所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤3）中，绿棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了0.025-0.075mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸和0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤，

或0.05-0.3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和0.1-0.3mg/L 吲哚乙酸的MSB培养基。

5.根据权利要求4所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤4）中，绿棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃和1.8-2.5g/L 凝固剂gelrite的MSB培养基。

6.根据权利要求5所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤5）中，绿棉胚性愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了1.9-3.8g/L KNO₃、1.8-2.0g/L 凝固剂gelrite、0.1-0.5g/L天冬酰胺和0.1-0.5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH₄NO₃的加入量减半的MSB培养基。